食品生物技术实验 食品科学系 徐文生

1. 食品生物技术实验食品科学系徐文生

2. 实验一小量制备质粒DNA

3. 一．实验目的及背景 • 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 • 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 • 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。

4. 1.质粒特点 • 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 • 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. • １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。

5. 2.质粒类型 • 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和严紧型质粒 • 1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。

6. 3.严紧型质粒 • 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。

7. 4.质粒的应用 • 大多数基因工程使用松弛型质粒。 • 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 • 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。

8. 二、本实验目的 • 本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。

9. 分离质粒DNA方法 • 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 • 碱变性法； • 煮沸法； • SDS法； • 羟基磷灰石层析法等 • 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。

10. 碱变性法基本原理 • 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。 • 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

11. 实验试剂 • ＬＢ培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH 7.5 NaCl 10g • ＳＴＥ： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA • ＡｍＰ 50mg/ml • 溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）

12. 试剂 • 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA • 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS • 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml • 酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 • ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA

13. pUC18 ■链长2,686 bp pUC18是适合于双脱氧法DNA测序的载体，在lacZ领域中含有多克隆位点，因此在含有IPTG， X-Gal的平板培养基上，很容易判断有无外源基因的插入。此外，也可以利用lac promoter表达外源基因。进行DNA测序时，可以很方便地使用M13系列Primers。 • 多克隆位点：EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I 和Hind III 只有一个酶切位点。 • ■用途 • 克隆外源基因。 • 利用lac promoter进行基因表达。 • 使用M13 primers进行DNA测序。 • pUC18/pUC19 cloning site图

14. 三．实验方法 • １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度。 • ２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。 • ３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟。 • ４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物，冰上放置5分钟。 • ５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 • ６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中。

15. (７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中。) • ８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。 • ９． １２０００g ,4 ℃离心５分钟。 • １０．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，１２000g 于4 ℃离心２分钟。 • １１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 • １２．加入50μl TE（含20μg/mlRNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。

16. 13．取10μl DNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比； 14. 同时以以下公式计算得率。 质粒DNA得率： 稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml 15．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。 16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。

17. 四．结果分析 • １．质粒DNA OD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和ＤＮＡ纯度。 • ２．记录电泳结果并说明结果内容。

18. 五、问题与讨论： • １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。 • ２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。 • 3. 沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？

19. 实验二 DNA凝胶电泳DNA agarose gel electrophoresis

20. 实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。

21. 实验材料和试剂 实验材料：质粒DNA等，购买或自行提取纯化。 实验试剂： • 5×TBE电泳缓冲液： • 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 • 溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10 mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。

22. 实验仪器 微波炉

23. 凝胶电泳槽

24. 凝胶成像系统

25. 实验步骤 • 取5×TBE缓冲液20mL加水至200mL，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。 • 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。 • 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

26. 加样：取10μL DNA样品与2μL 6×上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 • 电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。 • 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室温下染色20-25min。 • 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。

27. 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定： 1、 DNA的分子大小 2、 琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、 电源电压 5、嵌入染料的存在 6、 离子强度影响

28. DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带

29. 实验注意事项 • EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要专门处理后才可丢弃。 • 当EB太多, 胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30min后再观察。 • 制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀：速度也不可太快，否则容易出现气泡。

30. 思考题 • 泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？ • 溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA? • 影响本实验结果的因素有哪些？

31. 实验三 PCR扩增实验 原理： 利用特异的引物，以重组质粒pMD18-T为模板扩增基因。

32. 扩增反应 1.材料 1）扩增引物 2）模板：重组质粒pGEX-4T-1（His）6-C-X 3）PCR反应试剂盒（购置） 4）50×TAE缓冲液： 242g Tris碱 57.1ml 冰醋酸 100ml 0.5M EDTA H2O补充至1000 ml 5）6×凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖，4℃保存 6）溴化乙锭保存液：10mg／ml，避光保存 7）0.8％琼脂糖凝胶：0.8克琼脂糖加热溶于100 ml 1×TAE。

33. 2.操作步骤 1)按以下次序，将各成分在0.5ml灭菌离心管内混合：(100ul) ddH2O 79ul 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物， 2ul (终浓度为0.2mmol／L) MgCl2 6ul (终浓度为1.5mmol／L) 引物1 1ul (终浓度为50pmmol／L ) 引物2 1ul (终浓度为50pmmol／L ) 模板DNA 1ul 2)100℃加热反应混合液10分钟，冰浴5′，使DNA完全变性。 3)将1ulTaqDNA聚合酶(5单位/ul)，加入反应混合液中。 4)用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发。

34. 5）按以下方法进行PCR反应： 常用循环参数：①变性：94℃ 1分钟、②退火：55℃ 1分钟、③延伸：72℃ 1分30个循环。 6)制备1.5％琼脂糖凝胶板：将1.5％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化,稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳； 7)将凝胶板放人电泳槽，加入1×TAE缓冲液，使液面略高于凝胶。 8)从反应混合液中取出DNA扩增产物2 ul并加1ul 6×凝胶加样缓冲液，混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳。 9)电泳100V约1小时； 10)在500 ml 水中加入溴化乙锭保存液, (EB终浓度0.5-1ug/ml),混匀； 11)将疑胶轻轻滑入染色液，染色20-30分钟； 12)取出凝胶，用水稍漂洗； 13)紫外灯下确定DNA区带。

35. 注意事项 由于PCR能够使DNA分子大量扩增，所以应当注意防止反应体系被痕量DNA模板污染(Kwok和Higuchi，1989)。尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。

36. 1)在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他必需品。自动移液器的管部是常见的污染源，配液和移液时应当使用一次性吸头和活塞的正向排液式移液器。所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。1)在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他必需品。自动移液器的管部是常见的污染源，配液和移液时应当使用一次性吸头和活塞的正向排液式移液器。所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。 2)准备成套试剂，分装为小份，在靠近工作台的冰箱中设立专门位置来保存。配制试剂时，用从未接触过任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后将这一小份全部废弃，不得重新置存。

37. 3)装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心(10秒)。使液体沉积于管底，减少污染的机会。3)装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心(10秒)。使液体沉积于管底，减少污染的机会。 4)加完所有其他反应成分、包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA。模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻弹击管侧壁，混匀液体。再作瞬时离心(10秒)，使水相和有机相分开。

38. 5)将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应。并非即用管都应盖严。拿过模板DNA管后应更换手套。5)将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应。并非即用管都应盖严。拿过模板DNA管后应更换手套。 6)应设置阳性对照反应(即由少量适当的靶序列参与的PCR)。对靶序列的稀释工作应于实验前在实验室内别的位置进行，防止将靶DNA的浓溶液带到实验室中专门进行PCR的位置。 7)必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。