Puti Syahrani (20505015) - PowerPoint PPT Presentation

eron
puti syahrani 20505015 n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Puti Syahrani (20505015) PowerPoint Presentation
Download Presentation
Puti Syahrani (20505015)

play fullscreen
1 / 19
Download Presentation
170 Views
Download Presentation

Puti Syahrani (20505015)

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. Puti Syahrani (20505015) PERUBAHAN ASAM AMINO GLN MENJADI LEU PADA KODON rpoB513 Mycobacterium tuberculosis L1 RESISTEN RIFAMPIN Pembimbing: A. Saifuddin Noer, Ph.D

  2. Materi Presentasi • Pendahuluan • Tinjauan Pustaka • Metodologi Penelitian • Hasil dan Pembahasan • Kesimpulan

  3. Mycobacterium tuberculosis Penderita Tuberkulosis Antibiotik Pendahuluan Latar Belakang Data WHO 2006: • Menginfeksi 1/3 populasi dunia • 8 juta kasus TB aktif/tahun • Tingkat kematian 2 juta orang/tahun Indonesia : • Peringkat ketiga, tingkat kematian 140.000 orang/tahun • Jawa Barat peringkat keempat RESISTEN !!

  4. Mutasi pada gen rpoB No Kodon % Mutasi paling umum dan persentasenya 526 36% His  Tyr 23% 531 43% Ser  Leu 42% Pendahuluan Resistensi M. tuberculosis SINGLE MDR XDR Resisten Rifampin & Isoniazid rpoB – RIFR (Telenti, et al., , 1993; Musser, 1995; Ramaswamy, 1998) katG – INHR (Musser, 1995; Ramaswamy, 1998) • Mutasi gen rpoB (pengkode RNA polimerase subunit ) • Daerah penentu sifat resistensi RIF, 81 pb, kodon 507-533 • Dideteksi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) multipleks spesifik alel

  5. Pendahuluan Tujuan Penelitian Menentukan penyebab resistensi RIF pada isolat klinis M. tuberculosis MDRselain mutasi pada rpoB526 dan rpoB531 Isolat klinis M. tuberculosis MDR, katG- tetapi rpoB+ (tidak termutasi pada kodon rpoB526 dan rpoB531) (Noviana, 2006) Strategi: Amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) multipleks Sekuensing fragmen hasil PCR Analisis in silico


  6. Rifampin Interaksi RNAP Taq – RIF (Campbell, et al., 2001) Tinjauan Pustaka RNA Polimerase - Rifampin • RNA polimerase (RNAP) berperan pada proses transkripsi, terdiri atas subunit a, b, b’, s • Target rifampin (RIF), obat anti-TB lini pertama • RIF berikatan dengan RNAP subunit  pada kantung pengikatan RIF • RIF menghambat proses transkripsi dengan menghalangi jalur perpanjangan RNA (Campbell, et al.2001)

  7. Tinjauan Pustaka Fragmen AC Primer reverse B A C Primer forward Primer dalam Fragmen BC Polymerase Chain Reaction (PCR) Multipleks • Menggunakan sepasang primer luar (forward dan reverse), ditambah primer dalam • Mengamplifikasi sekaligus dua atau lebih fragmen target • Dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi pada posisi-posisi tertentu

  8. PCR Multipleks Sekuensing Analisis in silico Metodologi Penelitian Metodologi Penelitian PCR Multipleks: • rpoB526 dan rpoB531 • Isolat L1, L16, R4, R7 • Visualisasi gel agarosa 1,5% Sekuensing: • Macrogen Inc., Korea • 3730xl DNA analyzer • Salah satu primer • Fragmen 249 pb Analisis in silico: • Penjajaran (alignment) SeqMan dan MegAlign DNA Star • Pemodelan PyMOL

  9. 249 pb M C- C+ L1 L16 R4 R7 526 RR 1419 pb 249 pb CAC 517 pb RF R526 396 pb 214 pb 75 pb 181 pb 181 pb Hasil & Pembahasan Hasil PCR Multipleks rpoB526 M : pUC19/HinfI C+ : Kontrol + (M. tbc H37Rv) Ujung 3’ primer dalam komplemen dengan basa kedua kodon 526.

  10. 249 pb M C- C+ L1 L16 R4 R7 531 RR 1419 pb TCG 249 pb 517 pb RF R531 396 pb 214 pb 75 pb 167 pb 167 pb Hasil & Pembahasan Hasil PCR Multipleks rpoB531 M : pUC19/HinfI C+ : Kontrol + (M. tbc H37Rv) Ujung 3’ primer dalam komplemen dengan basa kedua kodon 531.

  11. Hasil & Pembahasan Rangkuman Hasil PCR Multipleks Hanya isolat M. tbc MDR L1 yang tidak termutasi pada rpoB526 dan rpoB531 Sekuensing

  12. Hasil & Pembahasan Penjajaran SeqMan DNA Star Penjajaran MegAlign : Mutasi A (adenin)  T (timin) pada basa kedua kodon rpoB513 (CAA  CTA) menyebabkan Gln (Q)  Leu (L)

  13. translasi Wild type (H37Rv) Glutamin (Gln, Q) (Polar/hidrofil, tidak bermuatan) mutasi Leusin (Leu, L) (Non polar/ hidrofob, alifatik) translasi Isolat L1 Hasil & Pembahasan Mutasi rpoB513

  14. O2 O2 Ne2 Hasil & Pembahasan Interaksi RIF-RNAP • Gln  Leu menyebabkan hilangnya ikatan hidrogen dengan RIF • Mengganggu interaksi RIF-RNAP & aktivitas inhibisi RIF • Dapat menyebabkan resistensi RIF Pemodelan dengan PyMOL

  15. Kesimpulan • Sifat resistensi RIF pada isolat klinis M. tuberculosis MDR L1 disebabkan adanya mutasi A  T pada basa kedua kodon rpoB513, yang menyebabkan perubahan asam amino Gln  Leu. • Perubahan ini dapat mengganggu interaksi RIF-RNAP sehingga RIF tidak dapat menginhibisi RNAP dan M. tuberculosis menjadi resisten RIF.

  16. SEKIAN TERIMAKASIH

  17. Metodologi Penelitian PCR Multipleks Siklus PCR : • Denaturasi awal: 96°C, 3 menit • 5 siklus: 95°C, 45 detik - 60°C, 1 menit - 72°C, 30 detik • 5 siklus: 95°C, 40 detik - 59°C, 50 detik - 72°C, 30 detik • 22 siklus: 94°C, 50 detik - 55°C, 40 detik - 70°C, 30 detik • Elongasi akhir pada 72°C selama 3 menit

  18. Tinjauan Pustaka (Campbell, et al., 2001) Inhibisi RIF terhadap RNAP Menjadi halangan sterik pada jalur perpanjangan RNA pada ujung 5’, ketika panjang transkrip 2-3 nukleotida

  19. Tinjauan Pustaka Daerah resistensi RIFpada RNAP subunit b Daerah resistensi RIF pada rpoB prokariot (E. coli, Taq, M. tbc) (Campbell, et al., 2001)