GeneXpert MTB/RIF
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GeneXpert MTB/RIF. GeneXpert MTB/RIF. teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid) permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB) baseado na técnica de PCR em tempo real. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

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Presentation Transcript

Genexpert mtb rif

GeneXpert MTB/RIF

  • teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid)

  • permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB)

  • baseado na técnica de PCR em tempo real


Genexpert mtb rif

Reação em Cadeia da Polimerase(PCR)

  • Um das principais ferramentas de biologia molecular

  • Desenvolvidapor Kary Mullis em 1983, resultando no prêmio Nobel em Química



Genexpert mtb rif

Melting

100

94 oC

Temperatura

50

0

T e m p o

3’

5’

5’

3’

PCR


Genexpert mtb rif

Melting

100

94 oC

Temperatura

50

0

T e m p o

3’

5’

PCR

94ºC

5’

3’


Genexpert mtb rif

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

3’

5’

5’

5’

3’

PCR


Genexpert mtb rif

30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

3’

5’

5’

5’

3’

PCR

94ºC

94ºC


Genexpert mtb rif

30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

3’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

PCR


Genexpert mtb rif

30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

5’

5’

5’

PCR

94ºC

94ºC


Genexpert mtb rif

30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCR


Genexpert mtb rif

30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

5’

5’

Fragmentos de tamanho definido

5’

5’

5’

5’

5’

PCR


Mais ciclos mais dna
Mais Ciclos = Mais DNA

Número de ciclos

0 10 15 20 25 30


Genexpert mtb rif

Amplificação

30 ciclos geram aproximadamente 109 moléculas

Permite aumentar a quantidade

de uma determinada amostra

Pode aumentar a quantidade

de um contaminante


Genexpert mtb rif

DNA polimerase de E. coli

  • Klenow (derivada da DNA Pol.I de E.coli)

extensão

desnaturação

anelamento

  • DESVANTAGENS: Temperatura ótima baixa e não é termoestável


Genexpert mtb rif

Breve Histórico

• O primeiro termociclador foi desenvolvido

na Cetus Corp. – Mr Cycle

• Projetado para que a DNA polimerase

pudesse ser adicionada a cada ciclo



Genexpert mtb rif

DNA Polimerase Termoestável

• 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC


Genexpert mtb rif

• Várias enzimas isoladas desse microorganismo

incluindo a primeira DNA polimerase termoestável

Taq DNA polimerase (1976)


Genexpert mtb rif

Taq DNA polimerase – temperatura ótima de 72ºC e é estável até temperaturas superiores a 94ºC


Genexpert mtb rif

Kary Mullis

Prêmio Nobel de Química em 1993


Genexpert mtb rif

Componentes de uma reação de PCR

1. Template (molde) (1–500 ng).

2. Primers (0.05–1.0 μM).

3. Mg2+ (0.5–5 mM).

4. dNTP (20–200 μMcada).

5. 1× PCR buffer

6. DNA polimerase (0.5–2.5 U para cada 50 μL de reação).


Genexpert mtb rif

PCR “padrão”

  • Permite amplificar uma determinada seqüência de DNA

    • Clonagem gênica

    • Sonda (northern blot, southern blot, hibridização in situ,...)

    • Seqüênciamento (identificação de amostra, análise filogenética, confirmação de transfecção)



Genexpert mtb rif

GeneXpert

(Cepheid)


Genexpert mtb rif

GeneXpert

(Cepheid)

















Diagn stico laboratorial da tuberculose
Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose

  • Métodos bacteriológicos . Métodos Moleculares

    -Baciloscopia -24hs - Fita Hain 3 dias ou mais

    (baciloscopia positiva +)

    -Cultivo – MGIT – 10 dias

    - Genexpert -2hrs

    - Sólido – 30 dias

    - Teste de Sensibilidade

    - MGIT -15 dias

    - Método das Proporções 28 a 42 dias


Diagn stico laboratorial da tuberculose1
Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose

Vantagens e Desvantagens

-Bacteriológico - Moleculares(Genexpert)

- Mais barato - Mais caro

(baciloscopia)

- TSA Mais demorado (MGIT) - Mais rápido Rif resit

- Outras drogas (INH, etc.) - Só para Rif

- Bacilos vivos - Bacilos Vivos e “mortos”

- Cultivar para TSA confirmatório

e outras drogas (quantidade de

escarro)

- Triagem

- Três códons relacionados a resistência a RIF

- Não detecta em amostras extra-pulmonares

- Não detecata MNT