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实验九 DNA 的重组与鉴定

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实验九 DNA 的重组与鉴定. 一 . 实验目的. 通过本实验学会重组 DNA 的原理与方法。. 基因片段. 质粒 DNA. 重组 DNA. 基因重组 ： 不同的 DNA 分子间发生共价连接形成重组 DNA 分子。. 二、实验原理.

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Presentation Transcript

  1. 实验九 DNA的重组与鉴定

  2. 一.实验目的 通过本实验学会重组DNA的原理与方法。

  3. 基因片段 质粒DNA 重组DNA 基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。

  4. 二、实验原理 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成的新的共价键，如质粒载体的两条链都带有5’磷酸，可生成4个新的磷酸二酯键，但如果质粒DNA已经去磷酸化，则只能行成2个新的磷酸二脂键，在这种情况下产生的杂交体分子带有2个单链切口，当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复。

  5. 实验原理 相邻的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。

  6. 重组DNA技术基本原理：切、接、转、筛

  7. 限制性内切酶 多种酶切口 单一酶切口 多克隆位点

  8. 切 限制性内切酶酶切 酶切

  9. 接 目的基因与载体的连接 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶

  10. T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h；

  11. 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接

  12. CCGG CCGG CGG C GGCC GGCC C GGC T4-DNA连接酶 CCGG HapⅡ GGCC CGG C C GGC 粘端连接

  13. AGCT AGCT TCGA TCGA AluⅠ DNA连接酶 AGCT TCGA 平端连接

  14. 转 重组体的转化 受体细胞

  15. Am JM109感受态 重组质粒 感受态 含氨苄平板

  16. 原核细胞的转化（细菌转化） 1)受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型：避免重组整合 转化亲和型：较高的可转化性 遗传互补型：利于筛选 感染缺陷型：防止感染

  17. 2）转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装 受体细胞 特殊处理 细胞膜特性改变

  18. 50-100mmol/L CaCl2 受体细菌 感受态细菌 重组体转入细菌 CaCl2处理

  19. 筛 连接 转化 目的基因 基因载体 连接酶 含氨苄平板 重组体克隆的筛选与鉴定 宿主细胞

  20. 转化后的克隆群体：

  21. 1.遗传检测法 1）抗药性标志的选择 Amp Tet 插入片段 pBR322 Tet平板 Amp平板

  22. 2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H COOH 片段 片段

  23. Lac Z X-gal 蓝色化合物 X-gal

  24. （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 N端序列 LacZ酶

  25. 2 电泳检测法 DNA Marker 空质粒 加样孔 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的PCR扩增片段 凝胶电泳检测

  26. 3 菌落杂交筛选法 原位杂交

  27. 三、实验仪器

  28. 超净工作台

  29. 台式高速冷冻离心机

  30. 恒温空气摇床

  31. 恒温培养箱 培养皿

  32. 恒温水浴锅

  33. 四、材料及试剂 E.coli DH5α pUC19 or T载体 λDNA

  34. 四、材料及试剂 1. T4DNA连接酶 2．10×T4DNA连接酶缓冲液: 400mmol/L Tris-Cl pH7.5 100mmol/L MgCl2 100mmol/L DTT, 500 μg/ml BSA 5-10mmol/L ATP

  35. 试剂 Kac ( 3mol/L，pH5.2) Xgal (20mg/ml) IPTG (200mg/ml) 灭菌去离子水

  36. 五、实验步骤 酶切 1.混合以下溶液于一个无菌离心管中 xμl pUC19 质粒 (0.1-4μg) 2μl 10×酶切缓冲液 1－5U 限制性内切酶（EcoRI） yμl 去离子水 终体积为 20μl 2.在推荐温度下育温1小时（一般为37℃） 加入5μl电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。

  37. 实验步骤 连接 1．混合以下试剂 PCR DNA 6 μl pUC19酶切回收 DNA 1 .0μl 5×T4DNA连接酶缓冲液 2.0μl T4DNA连接酶(10u/μl) 1μl 1 0μl 混合液于16℃培养12小时

  38. 转化及筛选 连接子的转化及筛选同实验一。

  39. 实验结果

  40. 实验报告 • 简述实验目的和实验原理及材料与试剂; • 详述实验步骤； • 画出实验结果示意图并分析。

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