细菌内毒素检查法

1. 《中国药典》2010年版培训班 细菌内毒素检查法 山东省药品检验所 2010.10

2. 主 要 内 容 • 细菌内毒素检查相关理论及概念 • 《中国药典》2010年版增修订情况 • 细菌内毒素检查法及注意事项

3. 细菌内毒素检查相关理论及概念 细菌内毒素 鲎试剂 鲎试剂与内毒素的反应机理 细菌内毒素检查

4. 名词解释 细菌内毒素检查法（Bacterial Endotoxins test） 热原检查法（Pyrogen test） LAL (Limulus amebocyte lysate) Test TAL (Tachypleus amebocyte lysate) Test Limulus Test

5. 细菌内毒素的发现 Boivin： 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。 Morgan：

6. 内毒素是由多糖、脂质和蛋白质组成的复合体。脂多糖又由化学和生物性质不同的特异O 抗原、核心多糖和类脂A（脂质A）组成。 内毒素的多糖结构

7. 细菌内毒素参考品的建立 • 不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同，为保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。 • 由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上处于中值的位置，且其稳定、可溶，因此一般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素参考品。

8. 标准内毒素与环境内毒素 标准内毒素： 指经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检查的参考品。 国际标准品（IS） 参考标准品 （RSE） 国家标准品（NS/RSE） 标准内毒素 工作标准品 （CSE）

9. 细菌内毒素的量值 • 80年代以前以重量作为内毒素的单位 • 1982年USP20引入以生物效价为量值的内毒素单位（ EU， Endotoxin Unit）

10. 细菌内毒素标准品的稀释 • CP2010年版规定内毒素标准品溶解后要在旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀释前要至少混合30秒，其他国家药典也有类似要求； • 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布 • 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结果

11. 世界上现存鲎的种类 • 鲎是一种海洋无脊椎动物，蓝色的血液。 • 种类以及分布： • 美洲鲎：北美洲东岸海域 • 中国鲎：中国东南沿海 • 南方鲎：泰国和马来群岛海域 • 圆尾鲎：东南亚西部海域

12. 鲎试验的发现 • 1956年Johns Hophins 大学动物学家Frederik. Bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚。 • 1963～1964年 Jack.Levin和Bang对细菌引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应。 • 多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行研究，阐释了凝聚机制

13. 鲎试剂与分类 鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 鲎试剂的种类： • 依据鲎的种类分： • 美洲鲎试剂（LAL） • 中国鲎试剂（TAL） • 圆尾鲎试剂（CAL） • 依据检查方法分： • 凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂 • 依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分： • 普通鲎试剂和特异性鲎试剂

14. （旁路反应） 内毒素 β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM 二价阳离子 活化的G因子 G因子 活化的C因子 C因子 B因子 活化的B因子 凝固酶原 凝固酶 凝固蛋白（凝胶） 凝固蛋白原 凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理 ——复杂的酶促反应过程

15. BET的目的和前提 • 确保药品不含有能导致患者发热反应发生的足量的细菌内毒素。 • 一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是SFDA允许的。 • 前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是内毒素。

16. 二、2010年版《中国药典》细菌内毒素检查法增修订情况二、2010年版《中国药典》细菌内毒素检查法增修订情况 • 2010版与2005版区别 • 修订背景 • 注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则

17. 2010版与2005版区别

21. 修订背景 1、细菌内毒素与检查用水除了强调内毒素含量外，还强调应对内毒素试验无干扰作用。 2、强调用干热灭菌法（ 250℃、30分钟以上）去除内毒素与热原法同步。 3、根据某些药（如抗肿瘤药）用体表面积计算给药量的需要，增加了按体表面积给药时的计算方法。

22. 注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则 • 本原则依据2010年版药典制订，适用于注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查项目时进行的实验及研究。

23. 需建立内毒素检查项目的品种 • 质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的品种。 • 用于注射给药，但未有热原质量控制的品种。 • 注射用新药需建立热原质量控制的品种。 • 用于静脉给药的原辅料

24. 建立方法时对鲎试剂及样品的要求 • 同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂 • 每个品种至少三批样品（上市品种应检测两个以上生产厂家；新药需检测连续生产的样品）。

25. 确定内毒素限值 • 一般按公式L=K/M计算。M为人每公斤每小时临床最大用药剂量，依据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。 • 儿童用药如大于成人，以儿童为准。 • 为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。 • 对于体积在100ml以上（包括100ml）的复方静脉输液类品种，内毒素限值一般按0.5EU/ml计。其他单方静脉输液品种除另有规定外也可按用药剂量计算，以EU/mg或EU/U表示。 • 对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒素检查法的品种可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的是国外药典的限值，应以最新版本药典为准。

26. 干扰实验 • 建议使用较低灵敏度鲎试剂 (0.5EU/ml或0.25EU/ml),以避免供试品中内毒素的阳性影响。

27. 三、细菌内毒素检查法

28. 细菌内毒素检查法 • 定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 • 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。

29. 1、概述 • 凝胶法 • 光度测定法 浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显色法）

30. 凝胶法 • 最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法 • 对干扰相对不敏感。 • 有两倍的误差 • 较光度测定法不灵敏

31. 光度测定法 • 灵敏（动态浊度检测限0.001EU/ml，动态显色0.005EU/ml） • 检测范围宽（动态浊度达到100EU/ml,动态显色50EU/ml） • 较之凝胶法易受干扰 • 对结果的解释更慎重。

32. 实验基本流程图 最大有效稀释倍数确定 供试品 限值确定 正式实验 供试品干扰实验 结果判断

33. 2. 试剂、仪器设备等 细菌内毒素检查法所应用的 试剂，主要包括：鲎试剂、细菌 内毒素检查用水、细菌内毒素工 作标准品等。

34. 国内鲎试剂的生产情况 • 安度斯生物技术有限公司 • 湛江海洋生物制品厂 • 福州新北鲎试剂厂 • 厦门鲎试剂厂 • 福州东方鲎试剂厂 • 福州平潭东方鲎试剂厂 • 广西北海鲎试剂厂

35. 细菌内毒素检查用水 1.药典规定： 凝胶法： < 0.015Eu/ml 光度法： < 0.005Eu/ml 且对内毒素试验无干扰作用 2. 和鲎试剂配套使用?

36. 细菌内毒素国家标准品(RSE) • 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

37. 细菌内毒素工作标准品(CSE) • 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

38. 仪器设备与实验器具 • 分析天平 • 超净工作台 • 细菌内毒素检查专用干式恒温器 • 电热恒温干燥箱 • 旋涡混合器

39. 实验器具 • 试管架、镊子、消毒棉球、称量瓶(30mm×60mm)、刻度吸管(1、2、5、10、15ml)、各种试管、中号金属饭盒、加样器等。 • 目前已有多种无热原的一次性用品

40. 实验器具的洗涤与除内毒素 • 实验中所使用的玻璃仪器清洁与否，直接影响试验结果。 • 实验中使用的所有玻璃器具一般经洗液浸泡后，取出用自来水、纯化水依次冲洗干净（可用纯化水浸泡）。

41. 实验器具的洗涤与灭菌 • 试验中所用的器皿，需要经过处理，除去可能存在的外源性内毒素。常用的方法是250℃干烤至少30分钟，达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温，一般约需6～8 小时。 • 将冲洗干净的试管、称量瓶、玻璃小瓶置金属饭盒内，吸管置金属筒内，放入烤箱，于250℃干烤至少30分钟，放冷，密闭保存备用。 • 灭菌后的实验器具应在规定时间内使用。

42. 实验器具的洗涤与灭菌 • 也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰细菌内毒素的检查。 • 除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内使用，否则须再次除去可能存在的外源性内毒素。 • 试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。

43. 3.供试品溶液的配制 • 按各药品项下规定，取供试品，精密称定于称量瓶(事先已除去外源性内毒素)中，按其效价或含量，用各药品项下规定的稀释剂稀释至规定浓度，充分摇匀使完全溶解，放置5～10分钟，再摇匀,放置备用。

44. 3.供试品溶液的配制 • 一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液的pH值，可以使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已经去除内毒素的容器中配制，缓冲液必须经过验证不含内毒素或干扰因子。

45. 3.供试品溶液的配制 • 注意事项： • 1、供试品溶液的浓度如以 **mg/ml表示，此**mg/ml是指供试品溶液中活性物质的浓度。 • 2 、样品初试时一般按照样品的估计百分含量或效价单位计算稀释液溶剂加入量，复试时，则必须根据该供试品的实际百分含量或效价来计算。 • 3.考虑供试品本身的体积

46. 4. 内毒素限值的确定 内毒素限值 L=K/M 每小时静注入人体内，不引起热原反应的最大内毒素剂量（阈值） K=5EU/（kg·h） • L 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单位）表示； • K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/ （kg·h）表示，注射剂K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）。

47. M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg 计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1 小时，按1 小时计算。 • 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

48. 内毒素限值 • 大输液 K=0.5EU/ml • 注射用水K=0.25 EU/ml • 注意M一定要找到最大量，如果有儿童用量，按体重计一般高于成人量

49. 内毒素限值 • 大部分药品的内毒素限值=k/最大给药剂量（mg/kg） • 假如剂量为14.3mg/kg， 内毒素限值=5/14.3=0.35EU/mg 假如此产品的浓度为100mg/ml 内毒素限值=0.35100=35EU/ml

50. 5.凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验 • 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。