slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
SCIENZE NATURALI ED UMANE PowerPoint Presentation
Download Presentation
SCIENZE NATURALI ED UMANE

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 26

SCIENZE NATURALI ED UMANE - PowerPoint PPT Presentation


  • 169 Views
  • Uploaded on

SCIENZE NATURALI ED UMANE. Ambiente fisico e biologico: interazioni con le attività umane nel passato e nel presente. UNITA’ BIOMEDICA: La Microscopia applicata alle scienze biomediche, quale mezzo di studio per l’ambiente biologico. Sommario. Parte Teorica (1 a lezione).

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'SCIENZE NATURALI ED UMANE' - emmanuel


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

SCIENZE NATURALI ED UMANE

Ambiente fisico e biologico: interazioni con le attività umane nel passato e nel presente

UNITA’ BIOMEDICA: La Microscopia applicata alle scienze biomediche, quale mezzo di studio per l’ambiente biologico.

slide2

Sommario

Parte Teorica (1a lezione)

1) Il microscopio ottico come punto di partenza

2) Dal microscopio ottico al microscopio elettronico: Principi di funzionamento di TEM e SEM

3) Il microscopio confocale (CLSM): principi di funzionamento

4) Principi di immunocitochimica: metodiche di evidenziazione di molecole e strutture cellulari per l’osservazione al CLSM

5) Esempi applicativi di TEM, SEM e confocale a ricerche in campo biomedico

slide3

Scala logaritmica delle dimensioni

1mm

Onde radio

100 m

Limite dell’occhio umano

75 m

Cellule epiteliali 40 m

10 m

Infrarosso

Emazie 6-7 m

Limite microscopio ottico a luce bianca

 1m

Batteri 2m

1 m

Visibile

Micoplasmi 0,1-0,2 m

Limite microscopio ottico a luce

ultravioletta

0,2-0,1m

0,1 m (1000 )

Ultravioletto

Virus 0,1-0,01m

0,01 m (100 )

Proteine

0,005-0,01m

0,001 m (10 )

Aminoacidi

8-12 

Limite microscopio elettronico

4 

0,0001 m (1 )

Atomi

1-4 

slide4

Il microscopio ottico come punto di partenza

Un po’ di storia...

Microscopio ottico semplice: 5 secoli fa

Microscopio ottico composto: alla fine del 1600 ad opera dei fratelli Jonssen in Olanda e Galileo Galilei in Italia

Dal 18° secolo in poi la microscopia ottica ha raggiunto livelli di grande qualità, dovuti allo sviluppo di componenti ottici e meccanici.

Dalla fine 19° secolo la competizione ha permesso una produzione qualitativamente alta e a prezzi contenuti

slide6

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

Un po’ di storia...

Berlino 1931: Prof. Ernst Ruska (Nobel nel 1986), intuisce che un campo elettromagnetico funzionava come una lente per gli elettroni.

7 Aprile 1931: Ruska & coll del gruppo del Prof. Max Knoll ottengono la prima foto al micr. Elettronico (17.400 X) Nascita della Microscopia Elettronica

1933: E. Ruska sviluppa il vero prototipo di Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM)

1939: TEM disponibile sul mercato

slide7

Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Un po’ di storia...

Tra il 1935 e 1938: M. Knoll ottiene le prime immagini relative alla topografia della superficie di un campione colpito da un fascio di elettroni. Basi per la costruzione del primo Microscopio Elettronico a Scansione (SEM).

1938: in Germania, M. von Ardenne progetta il primo strumento

1965 il SEM diventa commercialmente disponibile

slide8

Confronto tra MO, TEM e SEM

Elettronico

a trasmissione

Elettronico

a scansione

Ottico

slide9

Microscopio Elettronico

a Trasmissione

REQUISITI DEL CAMPIONE: sezioni sottili (60-80nm) di materiale incluso in resine plastiche, oppure preparati liberi di spessore molto limitato.

INFORMAZIONI OTTENIBILI:relative alla struttura interna del campione.

SISTEMA ILLUMINANTE: sorgente ottenuta da un filamento di tungsteno riscaldato sotto vuoto. Il fascio elettronico originato viene focalizzato sul campione mediante lenti elettromagnatiche.

SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: l’immagine della zona osservata viene ottenuta in modo simultaneo su di un apposito schermo fluorescente sotto il campione.

LIMITE DI RISOLUZIONE:in relazione ai parametri di osservazione scelti può essere molto elevato: 0,2-0,3nm.

slide10

Modificazioni subite da un fascio elettronico primario che interagisce con un materiale

  • DIFFUSIONE ANELASTICA (e- - e- orbitale esterno atomo):
  • Diminuzione di energia senza apprezzabile perdita di direzione.
  • DIFFUSIONE ELASTICA (e- - nucleo atomico):
  • Variazione di direzione senza apprezzabile perdita di energia.
slide11

Segnali emessi da un campione biologico colpito da un fascio di elettroni

  • Elettroni Secondari (SE) fascio di elettroni primario - e- orbitali esterni. Bassa energia  50 eV. Informazioni da stati superficiali (10nm) MORFOLOGIA DI SUPERFICIE
  • Elettroni Retrodiffusi o backscattered (BSE) urti elastici Energia  50 eV. Informazioni di tipo compositivo o morfologico di strati profondi (alcuni m.
  • Catodoluminescenza presenza di sostanze luminescenti
  • Radiazioni X emissione di SE da orbitali interni: a seconda dello spettro di r. X emesse si può risalire agli elementi costituenti il campione (MICROANALISI)
slide12

Microscopio Elettronico

a Scansione

REQUISITI DEL CAMPIONE: frammenti di materiale da pochi mm3 sino all’ordine di cm3 (per i campioni biologici, da cellule in coltura a frammenti di tessuti).

INFORMAZIONI OTTENIBILI:relative, nella modalità principale di osservazione, alla superficie del campione, con la formazione di immagini di aspetto tridimensionale.

SISTEMA ILLUMINANTE: stessa sorgente del TEM

SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: non esistono lenti magnetiche al di fuori di quelle utilizzate per la focalizzazione del fascio. L’immagine viene ottenuta sulla superficie di un tubo a raggi catodici, mediante elaborazione elettronica del segnale proveniente dal campione.

LIMITE DI RISOLUZIONE:in relazione ai vari parametri di osservazione scelti può essere da 5 a 30nm.

slide13

Elettronico a trasmissione

  • Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture interne di cellule o tessuti in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici degli stessi
  • Localizzazione di molecole interne a cellule o tessuti preventivamente marcati
  • Osservazione di virus

Elettronico a scansione

  • Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici di cellule o tessuti
  • Localizzazione di recettori di superficie preventivamente marcati
slide15

Microscopio Confocale

Laser (CLSM)

REQUISITI DEL CAMPIONE: tecnologia non invasiva, consentendo l’osservazione del preparato a pressione ambiente, è ideale per lo studio di campioni biologici viventi (es. cellule in coltura) rendendo accessibile lo studio dinamico dei fenomeni vitali. Inoltre, sono osservabili tutti i campioni i cui componenti, strutturali e non, siano stati in qualche modo “colorati “ con sostanze o capaci di emettere luce colorata se colpite da un raggio laser (fluorocromi) od in grado di deviare il laser stesso (es. atomi ad alto peso molecolare come oro, argento, platino, cadmio)

INFORMAZIONI OTTENIBILI: relative alla distribuzione, nell’intero volume del campione (sia esso un frammento di tessuto o cellule in coltura) di componenti strutturali e non dello stesso capaci di emettere, da soli od in seguito ad opportune colorazioni, un segnale luminoso quando colpito da un raggio laser.

SISTEMA ILLUMINANTE: una sorgente di luce laser costituita da una miscela di gas tale da generare raggi luminoso nell’intero spettro della luce viusibile od ultravioletta.

SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: l’immagine viene ottenuta sulla superficie di un tubo a raggi catodici, mediante elaborazione elettronica del segnale proveniente dal campione.

LIMITE DI RISOLUZIONE: circa 0,2m

slide16

Il laser: la sorgente luminosa

Si utilizzano lasers a gas ionizzato e ciascun tipo di laser ha delle linee di emissione per un limitato numero di .

Tipi di lasers:

ARGON

Blu (488nm) e Verde (514nm)

He-Ne

Verde (543nm) e Rosso (633nm)

KRIPTON

Giallo (568nm) e Rosso (647nm)

ARGON ad alta potenza

Ultravioletto  < 400nm

ELIO-CADMIO

Necessitano di un sistema di raffreddamento liquido (molto costosi)

slide17

Microscopio Confocale

Laser (CLSM)

Vantaggi

Informazioni relative ai vari piani focali del campione (informazioni di profondità)

Maggiore nitidezza delle immagini

Struttura tridimensionale del campione

slide18

Microscopio confocale laser

  • Localizzazione di molecole autofluorescenti o marcate con sonde fluorescenti
  • Visualizzazione di strutture cellulari (es. citoscheletro)
  • Osservazioni sul ciclo cellulare (marcatura del nucleo con opportuni coloranti fluorescenti)
  • Apoptosi
slide19

Sommario

Parte Teorico-pratica (2a lezione)

1) Cenni introduttivi per la preparazione di campioni per TEM e SEM

2) Osservazione diretta di campioni biologici al SEM

3) Passaggi fondamentali per la preparazioni di campioni biologici per il SEM

4) Colorazioni citologiche per l’osservazione al microscopio ottico

slide20

Fasi principali della preparazione di campioni per la Microscopia Elettronica a Trasmissione ed a Scansione

1) Prelievo

  • Particolare cura nell’evitare traumatizzazioni della zona da esaminare
  • Il campione ottimale deve avere le minime dimensioni richieste per attuare un’adeguata fissazione, disidratazione ed inclusione in resina
  • Delicata pulizia del campione con soluzione fisiologica o tampone
  • Le suddette operazioni devono essere eseguite in tempi brevi
slide21

2) Fissazione

Ha lo scopo di immobilizzare tutti i componenti molecolari e macromolecolari dell’architettura cellulare, provocando l’arresto istantaneo di tutte le attività chimico-fisiche cellulari

Tipi di fissativi (+ usati):

a) GLUTERALDEIDE 2-4%  reticola le proteine

b) TETROSSIDO DI OSMIO 1-2%  fissa lipidi e proteine

I fissativi sono veicolati da un opportuno tampone.

Principali tamponi:

a) Tampone fosfato (+ usato);

b) Tampone cacodilato (sodio metil arsenato);

c) Tampone veronal-acetato (altamente tossico)

slide22

3) Disidratazione

Ha lo scopo di allontanare completamente i fluidi presenti nel campione, per poterlo poi sottoporre ai procedimenti di inclusione (trasmissione), ricopertura (scansione) e osservazione sotto vuoto.

Passaggi:

Etanolo 50% 10min

“ 70% 10min

“ 85% 10min

“ 90% 10min

“ 95% 10min

“ 100% 2x20min

Trasmissione

Scansione

slide23

Trasmissione

4a) Inclusione in resina

La resina fornisce il sostegno necessario per tagliare il campione in fettine sottili. Si effettua un’impregnazione nei monomeri resinosi (fluidi) che verranno successivamente polimerizzati e resi solidi.

Passaggi:

Etanolo 100% + Acetone assoluto (1:1) 15min

Acetone assoluto (rischiarante, miscibile con le resine) 15min

Resina + Acetone (1:1), 24h

Resina pura 24-48h

Resina da inclusione 3-4gg in stufa a 70°C

slide24

Trasmissione

5a) Taglio con ultramicrotomo

2 Tipi di sezioni:

A) Semi-fine  ottico, colorandole con blu di metilene, spessore 1-2m

B) Fine  elettronico, spessore 400-600nm (0,4-0,6m)

6a) Contrasto

Mediante applicazione di soluzioni saline di elementi ad elevato peso atomico (Acetato di uranile e citrato di piombo)

Osservazione al TEM

slide25

Scansione

4b) Critical Point Drying

Completa la disidratazione del campione, permettendo di mantenere il più possibile inalterata la superficie del campione

Passaggi:

Etanolo assoluto + Acetone assoluto (1:1) 15min

Acetone assoluto 15min

CPD in CO2 liquida

5b) Montaggio

Mediante vernicette colloidali costituite da elementi conduttivi (Ag, Cu, C) o nastri adesivi.

  • Attacco del campione al substrato
  • Assicura la conducibilità termica ed elettrica

6b) Ricopertura

  • Perché la ricopertura:
  •  conducibilità elettrica del campione  minori effetti di carica
  •  danneggiamento termico
  •  emissione elettronica secondaria

Osservazione al SEM

slide26

Fasi principali della preparazione di campioni per la

Confocale

1) Fissazione

Un fissativo ottimale deve:

A) Mantenere l’antigenicità del campione

B) Minimizzare la comparsa di artefatti.(es. la gluteraldeide dà origine a derivati autofluorescenti  da non usare)

In genere si usa paraformaldeide (2-4%) o metanolo a freddo

Antigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazione

2) Immunomarcatura

Antigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazione

3) Controcolorazione, per evidenziare strutture cellulari (nucleo, citischeletro etc.)