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A inabilidade de células TCD4 + Stat3 -/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a menor proliferação , aumento da apoptose ou ambos?. Controle: Stat3 fl/fl. 5, 7, 9 e 14d. Linfonodos Mesentéricos Baço. TCD4 + naïve marcadas CFSE. FACS CFSE +.

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Presentation Transcript

  1. A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a menor proliferação, aumento da apoptose ou ambos? Controle: Stat3fl/fl 5, 7, 9 e 14d • Linfonodos Mesentéricos • Baço TCD4+ naïve marcadas CFSE FACS CFSE+ (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl Rag2-/- 98,11 86,4 39,2 81,7 STAT3 influencia, portanto, no potencial de proliferação de TCD4+. Já a ausência de Stat3 atrasa mas não impede a proliferação celular.

  2. A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a menor proliferação, aumento da apoptose ou ambos? anti-CD3, anti-CD28 IL-6 ou IL-21 Controle: Stat3fl/fl FACS Annexin-V/PI TCD4+ naïve (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl 72h STAT3 além de influenciar na proliferação de TCD4+, regula também a sobrevivência de células T.

  3. STAT3 regula então quais genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação? Regulação gênica Controle: Stat3fl/fl ChIP-Seq anti-pSTAT3 anti-H3K4Me anti-CD3, anti-CD28 IL-6, TGF-β, anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ IL-6 1h TCD4+ Baço e linfonodos TCD4+ naïve CD4+CD44-CD62L+ (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl 72h

  4. STAT3 regula então quais genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação? Expressão gênica Controle: Stat3fl/fl anti-CD3, anti-CD28 IL-6 e/ou TGF-β, anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ IL-6 1h Microarray PCR em Tempo Real TCD4+ Baço e linfonodos TCD4+ naïve CD4+CD44-CD62L+ (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl 72h STAT3 é importante para na regulação de genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação, mas não é o único fator.

  5. Conclusões STAT3 é essencial para é essencial para a diferenciação de células Th17, in vivo, no modelo de colite e, na sua ausência as células T tendem a diferenciarem-se em Treg; Na diferenciação para Th17, STAT3 é tanto fator de transcrição, quanto regulador transcricional; STAT3 tem papel importante na proliferação de células TCD4+ durante respostas inflamatórias; Entretanto STAT3 é não essencial para expansão homeostática de células TCD4+, devendo, portanto, atuar em comunhão com outros fatores de transcrição.

  6. Objetivo Determinar a participação de STAT3 no desenvolvimento de Th2, através da avaliação da produção de citocinas e expressão de fatores de transcrição.

  7. STAT3 é ativadodurantediferenciação de Th2? Anti- Phospho-STAT3 e STAT6 IL-4 anti-INF-γ Anti-CD3 e Anti-CD28 + Stat3CD4-/- WT Citometria TCD4 naive

  8. STAT3 é ativadodurantediferenciação de Th2? Anti- Phospho-STAT3 e STAT6 DO11.10 APC Anti-CD3 ou OVA + Céls. T TCR transgênicas Citometria STAT3 é fosforiladodurantediferenciação de células Th2.

  9. Quaiscitocinasparticipamdaativação de STAT3 durantediferenciação de Th2? Acs Bloqueio Anti-CD3 e anti-CD28 + ELISA TCD4 naive 5 dias WT 4 dias FACs IL-2, IL-6 e IL-21 participamnaativação de STAT3 durantediferenciação de células Th2 (umavezque o bloqueio das mesmasprejudica a expressão de citocinas Th2)

  10. STAT3 é requeridonadiferenciação de Th2? Anti-CD3 e Anti-CD28 IL-4 e anti-INF-γ reestimuladas + 1x106 céls 5 dias Anti-CD3/24h Stat3CD4-/- WT ELISA TCD4 naive

  11. STAT3 é requeridonadiferenciação de Th2? Anti-CD3 RNA qPCR Stat3CD4-/- WT TCD4 naive STAT3 é importantenadiferenciação de Th2

  12. STAT3 é requeridoparaexpressão de fatores de transcrição? Diferenciação céls Isolamento céls Diferentes dias Expressão gênica RNA Stat3CD4-/- WT TCD4 naive qPCR STAT3 é requeridopara a expressão de fatores de transcrição.

  13. STAT3 é requeridoparaexpressão de fatores de transcrição (estáenvolvidonasmodificações do DNA)? Stat3CD4-/- WT TCD4 naive Diferenciação ou não de céls Imunoprecipitação Cromatina (ChIP) qPCR H3K4me3 H3K36me3 Ativação gênica Este resultadosugereque Stat3 tem um papelnaprevençãodestasmodificações H3K17me3- Inibição gênica

  14. STAT3 é requeridoparaexpressão de fatores de transcrição (interage com o DNA)? Anticorpo controle ChIP qPCR WT Anticorpos STAT3 TCD4 naive

  15. STAT3 é requeridoparaexpressão de fatores de transcrição (afetaacessibilidade com a cromatina)? Diferenciação 5 dias Isola núcleo Digestão c nuclease 10 min* WT Stat3CD4-/- qPCR TCD4 naive Stat3 interage com o DNA e a acessibilidade com a cromatina é diminuída. * Nuclease cliva o DNA em pontos acessíveis que tem modificações ativas na transcrição.

  16. A transdução de algunsfatores de transcriçãopara o Stat3CD4-/- resultana “recuperação”daprodução de citocinas? Reestimulação Diferenciação 2 dias Anti-CD3 por 24h Trandução c CT, Batf ou Maf c expressão de retrovírus Stat3CD4-/- WT TCD4 naive ELISA Maf e Batfprovavelmenterepresentamalvos de STAT3 durantedesenvolvimento de Th2, e osdefeitosnaprodução de citocinas Th2 naausência de STAT3 sãoresultados de efeitos downstream dos fatores de transcrição.

  17. STAT3 ativado é capaz de restaurar a produção de citocinas de padrão Th2? Mutantespara STAT constitutivamenteativos Reestimuladas Transdução Com C ou STAT3C TCD4 naive 5 dias Anti-CD3/24h 48h ELISA Ativadas

  18. STAT3 e STAT6 cooperamnaprodução de citocinas de padrão Th2? Mutantes para STAT constitutivamente ativos Reestimuladas Transdução com C, STAT6VT, STAT3C ou ambos 48h sob condições Th1 5 dias Anti-CD3/24h TCD4 naive ELISA

  19. STAT3 e STAT6 cooperamnaprodução de citocinas de padrão Th2 in vivo? TCD4 isoladas do baço de: Anti-CD3 por 24h WT STAT6VT STAT6VT Stat3Cd4-/- ELISA Estes resultadosdemonstraramque STAT3 e STAT6 cooperamnaprodução de citocinas de padrão Th2

  20. STAT3 atuasobreos genes alvo de STAT6? Anti-CD3 e anti-CD28 3 dias ChIP-anti-STAT6 Sob condições Th2 Stat3CD4-/- WT qPCR TCD4 naive

  21. STAT6 foicapaz de induzirexpressão de fatores de transcriçãonaausência de STAT3? TCD4 isoladas de: reestimuladas 6 h Anti-CD3 RNA WT STAT6VT STAT6VT Stat3Cd4-/- qPCR Estes resultadossugeremque STAT3 facilita a habilidade de STAT6 ligaraos genes alvo e naindução da expressão de fatores de transcrição.

  22. STAT3 é requeridoin vivo paradiferenciação de Th2 nainflamaçãoalérgica? Desafios intranasais Imunização Contagem OVA e Alum BAL 2 semanas após 2seg imunização WT Stat3CD4-/- FACs

  23. STAT3 é requeridoin vivo paradiferenciação de Th2 nainflamaçãoalérgica? BAL e Sobrenadante de cultura Esplenócitos OVA por 72h ELISA Stat3CD4-/- WT

  24. STAT3 é requeridonainflamaçãoalérgicain vivo? Blefarite e dermatite alérgica WT STAT6VT STAT6VT Stat3Cd4-/- Eosinófilos do BAL

  25. STAT3 é requeridonainflamaçãoalérgicain vivo? Pulmão Hematoxilina-eosina STAT6VT Stat3Cd4-/- STAT6VT WT Estes resultadosdemonstraramque a perda de STAT3 emcélulas T protege o camundongo do desenvolvimento de doençasinflamatóriasmediadaspor Th2.

  26. Conclusão STAT3 STAT6 Proteção contra doenças inflamatórias IL-2 STAT5 IL-4 Th2 STAT6 STAT3 IL-6/IL-21/IL-2

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