实验二

1. 实验二 小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定

2. 实验目的 • 掌握RNA操作注意事项 • 了解鉴定RNA含量和质量的方法 • 了解RNA抽提原理 • 熟悉RNA抽提方法

3. 实验原理 • 理论基础： 真核生物结构基因有内含子 基因在转录水平的表达 • 实验原理：四步骤 组织或细胞匀浆 分离总RNA 纯化RNA 检测RNA的纯度及完整性

4. 理论基础 • 真核生物中绝大多数基因有内含子，如直接由基因组克隆目的基因，不利于编码基因的序列分析及体外利用原核细胞表达。提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段。 • 检测基因在转录水平的表达，需检测mRNA含量，定量RT-PCR是主要方法之一。

5. 内含子 外显子

6. 实验原理 • 抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质，常用酸性酚法。在酸性条件下苯酚可溶解DNA而不溶解RNA，同时酚又是蛋白变性剂。利用酸性酚试剂加氯仿共抽提，可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离。最后利用异丙醇沉淀，即可获得纯化的总RNA。

7. RNA产物的鉴定 • RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验。 • 高纯度RNA的A260/A280应处于1.6至1.8之间， • A260与RNA浓度呈正比，1 OD = 40μg/ml RNA。 • RNA的完整性可通过电泳检测 • RNA为单链分子，二级结构复杂，需先经甲酰胺变性，再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。 • 细胞总RNA以rRNA含量最高，电泳时可观察到18S与28S rRNA两条清晰条带，且亮度之比接近1:2，表明RNA没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带，主要由5S、5.8S rRNA 与tRNA组成。

8. 28S 18S 5S RNA电泳结果示意图

9. 28 S 18 S 5 S RNA电泳结果凝胶成像图

10. 取小鼠肝组织匀浆 • 处死小鼠 • 匀浆 取肝50~100g Trizol 1ml 匀浆

11. RNA纯化操作步骤 • 加入氯仿0.2ml，剧烈振荡，室温放置10分钟。12000rpm离心15min，取上清。 （离心后溶液分为三相，即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相，绝不能有中层蛋白混入。） • 加入异丙醇0.5ml，振荡混匀，室温放置10分钟，12000rpm离心10min，弃上清。 （加入50％的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当。） • 1ml 75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，重复一次。 • 空气干燥沉淀，溶解于20μl DEPC-H2O。留样2μl，其余－70℃保存备用。

12. RNA电泳操作步骤 • 制备琼脂糖凝胶：首先将0.5g琼脂糖溶化于32ml水，冷却至60℃。加入5×甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml，37％甲醛水溶液9ml，混合均匀并灌制胶板。 • 取1μl RNA溶液，加入甲酰胺-上样缓冲液9μl，95℃变性5分钟，迅速冰浴冷却。点样。 • 150V电泳30分钟，紫外灯下观察电泳结果。

13. 分光光度法操作步骤 • 加1μl RNA溶液于0.4ml DEPC-H2O，充分混匀，读取260nm与280nm的吸光度数值。

14. 操作注意事项（一） • 因为RNA酶分布广、活性强、且难以失活， 使RNA极易降解，操作时应特别注意： • 高压消毒实验器皿，烤干。 • 以0.1% DEPC过夜处理所有试剂配置用水，并高压消毒。 • 抽提RNA时，应戴手套和口罩，少说话。

15. 操作注意事项（二） • DEPC是强烈的烷化剂，通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶活性，是消除外源性RNA酶的主要方法。但CEPC有致癌作用，并具有很强的反应性，因此注意： • 使用时，不直接接触 • DEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理，使DEPC分解后使用。

16. 操作注意事项（三） • 为避免酶蛋白反复冻溶而失去活性，酶制剂溶于50％的甘油中，-20oC储存可保持液状。但高浓度的甘油对酶促反应有抑制作用，因此酶的用量不能超过反应体积的1/10。 • 在进行各种酶促反应时，应首先加水，再加入其它成分，最后加酶。