次级代谢产物

3. 次级代谢产物

4. 两个概念 ：初级代谢产物，次级代谢产物 • 初级代谢产物：是指微生物产生的，生长和繁殖所必需的物质，如蛋白质、核酸等。 • 次级代谢产物：从初级代谢途径中形成分枝代谢途径，并用初级代谢产物生成与菌体生长繁殖无关的物质或功能还未明的化合物，这个过程称次级代谢，产物称次级代谢产物，如抗生素、毒素、色素。

5. 从菌体生化代谢角度来说，由于次级代谢产物的化学结构是多种多样的，菌体合成抗生素的生化代谢途径也是多样的。但许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的。所以，次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢产物合成途径并不是独立的，而是与初级代谢产物合成途径有着密切的关系。从菌体生化代谢角度来说，由于次级代谢产物的化学结构是多种多样的，菌体合成抗生素的生化代谢途径也是多样的。但许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的。所以，次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢产物合成途径并不是独立的，而是与初级代谢产物合成途径有着密切的关系。

6. 次级代谢产物的类型： （1）抗感染抗生素 （2）抗肿瘤抗生素 （3）免疫抑制剂 （4）降胆固醇剂 （5）杀寄生虫剂 （6）植物生长激素 （7）杀真菌抗生素 （8）生物杀生剂

7. 微生物次级代谢产物抗生素的研制中Β-内酰胺抗生素已成为主要产品微生物次级代谢产物抗生素的研制中Β-内酰胺抗生素已成为主要产品

8. 次级代谢产物的经济效益是巨大的 据统计，次级代谢产物的国际市场估计年产值高达500多亿美元以上。

9. 造福人类的青霉素 青霉素G 青霉素V

10. 青霉素是指分子中含有青霉烷，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。 青霉素又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、 配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青 霉素钾。

11. 按其特点可分为 ： 青霉素G类：如青霉素G钾、青霉素G钠、长效西林等。 　　青霉素V类：(别名：苯氧甲基青霉素、6-苯氧乙酰胺基青霉 烷酸) 如青霉素V钾等（包括有多种剂型）。 耐酶青霉素：如苯唑青霉素(新青Ⅱ号)、氯唑青霉素等。 广谱青霉素：如氨苄青霉素、羟氨苄青霉素等。 　　抗绿脓杆菌的广谱青霉素：如羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、 呋苄青霉素等。 　　氮咪青霉素：如美西林及其酯匹美西林等，其特点为较耐酶， 对某些阴性杆菌(如大肠、克雷伯氏和沙门氏菌)有效，但对绿脓杆菌效差。

12. 青霉素的基本结构与生物合成 选育青霉素生产菌 青霉素的工业生产 青霉素的发酵控制 青霉素的生物合成的调控 青霉素工业生产中注意的问题 青霉素生产的发展

13. 青霉素的基本结构与生物合成

14. 青霉素的基本结构（活性母核）： 6—氨基青霉烷酸 （6—APA）

15. 噻唑烷环和β—内酰胺环融合 β—内酰胺环 噻唑烷环

16. ① L-α-氨基己二酸 青霉素生物合成前体 ② L- 半胱氨酸 ③ L-缬氨酸

17. 三肽合成酶 （LLD—ACV） 异青霉素N合成酶 （异青霉素N） 异青霉素N酰基转移酶 酰基辅酶A 、苯乙酸 （青霉素G）

18. 选育青霉素生产菌

19. 1、出发菌株的选择 青霉素产生菌主要是产黄青霉。开始生长时，孢子先胀大，长出芽管并急速伸长，形成隔膜，繁殖成菌丝，然后产生复杂的分支，交织为网状而成菌落。菌落外观有的平坦，有的褶皱很多，一般都是圆形的。在发育过程中从气生菌丝形成大梗和小梗，于小梗上着生分生孢子，排列成链状，形状似毛笔。分生孢子有椭圆形、圆柱形、圆形，每种菌种的孢子均具有一定的形状，多次传代后也不改变。 2、切断支路代谢 （1）当菌种的初级代谢和次级代谢处于分路途径时，初级代谢产物的营养缺陷突变菌株常可使相应的次级代谢产物增产。 （2）青霉素的生物合成受赖氨酸的反馈抑制，这是由于赖氨酸可使高柠檬酸合成酶受到抑制或阻遏，因此选育赖氨酸缺陷突变株，通过在培养基中限量添加赖氨酸，可使青霉素产量明显提高。

20. 3、解除菌体自身的反馈调节 （1）选育结构类似物抗性突变株 （2）筛选自身耐受性突变株 （3）筛选前体或前体类似物抗性突变株 （4）选育营养缺陷型的回复突变株

21. 4、增加前体物的合成 缬氨酸是产黄青霉生物合成的前体物。乙酰羟酸合成酶将丙酮酸转变为乙酰乳酸，最后形成缬氨酸。但是，过量的缬氨酸会反馈抑制乙酰羟酸合成酶。通过诱变选育缬氨酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制比亲株小的产黄青霉，使细胞内积累较多的缬氨酸，是青霉素产量大幅度提高。

22. 青霉素的工业生产

23. 丝状菌发酵工艺流程 产黄青霉 真空冷冻干燥或液氮保藏孢子 斜面孢子 琼脂斜面培养基上25℃培养7~9天 米孢子 用斜面孢子悬浮液接种于大米或小米基质上25℃培养6~7天 补料： 葡萄糖 硫酸铵 氨水 苯乙酸 消沫剂 种子罐 用孢子米粒或孢子悬浮液接种，26 ℃通气、搅拌培养60~68h 发酵罐 用种子罐按10%~15%体积接种，在25 ℃及通气、搅拌下补料分批培养200~240h 发酵液 冷却至5 ℃左右，絮凝、过滤 发酵滤液 用15%硫酸调节pH2.0~2.2，按1：3.5~1：4.0体积比加入乙酸丁酯（BA）及适量破乳剂，在5 ℃左右进行逆流萃取 一次BA萃取液

24. 一次BA萃取液 按1：4~1：5体积比加入1.5%NaHCO3缓冲液，在5 ℃左右进行逆流反萃取 一次水提液 用15%硫酸调节pH2.0~2.2，按1：3.5~1：4.0体积比加入乙酸丁酯（BA），在5 ℃左右进行逆流萃取 一次BA萃取液 加入粉末活性炭，搅拌15~20min脱色，然后过滤 脱色液 按脱色液中青霉素含量计算所需钾量的110%加入25%乙酸钾丁醇溶液，在真空度>0.095MPa及45~48 ℃下共沸结晶 结晶混悬液 过滤，先后用少量丁醇和乙酸乙酯各洗涤晶体两次 湿晶体 在>0.095MPa的真空及50 ℃下干燥 青霉素工业盐

25. 表一

26. 青霉素的发酵控制

27. 温度青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 °C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。

28. 在青霉素发酵生产中,通常采用25℃恒温控制法。抗生素发酵一般不能在整个发酵周期内只选一个最合适的培养温度,因为适合于菌生长的温度不一定适合于抗生素的合成,反之,适合于抗生素合成的温度亦不一定适合于菌的生长。青霉菌的最合适生长温度为30℃,而最适于青霉素合成的温度是20℃左右。在青霉素发酵生产中,通常采用25℃恒温控制法。抗生素发酵一般不能在整个发酵周期内只选一个最合适的培养温度,因为适合于菌生长的温度不一定适合于抗生素的合成,反之,适合于抗生素合成的温度亦不一定适合于菌的生长。青霉菌的最合适生长温度为30℃,而最适于青霉素合成的温度是20℃左右。

29. 在青霉素发酵前期0~50h把温度控制在最适合青霉菌生长的30 ℃，可促进菌丝迅速生长尽可能提前进人抗生素分泌期。在51~160h 间，把温度控制在最适于青霉素合成的20 ℃ ，可增加抗生素分泌量并维持较长的分泌期，而160h后又升温培养，可刺激抗生素的分泌 ，虽然这样会加速菌丝衰老，但因已近放罐，无碍大局，这个温度控制在25 ℃较好，过高如30 ℃ 会使菌丝过快衰老，反而不利于增长单位，而温度偏低 如 20℃ 则起不到刺激后期抗生素分泌的作用，会使单位偏低。

30. pH 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0。

31. 溶氧 在青霉素发酵过程中，溶氧有个限值，在此值之下，青霉素的产量会越来越低，直到青霉素不在产出为止。我们称这一点为临界点。大多数情况下高粘度发酵液控制溶氧值为30%，低粘度发酵液控制溶氧值为20%。通过电极插入罐中发酵液来测量溶氧值，并且匀速搅拌，即使假设发酵罐中每一点的搅拌都是相同的（这实际上是不可能实现的），因为发酵液中每一点的生物量都不同，所以所测的值不是真实的值。如果仅仅是不同的压力的影响，罐底部的溶氧实际上要比电极测的要高。而表面溶氧值要比电极在表面所测的溶氧值要低。

32. 菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。

33. 菌丝生长速度用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。

34. 菌丝形态在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。

35. 在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。

36. 青霉素的生物合成的调控

37. 生物合成的调控： 1、碳源调控 青霉素的生物合成在很大程度上受葡萄糖和蔗糖及在较小程度上受麦芽糖、果糖、甘露糖等其他糖的调控，而不受乳糖调控。研究表明，葡萄糖能被菌体迅速利用而有利于菌体生长，但抑制青霉素合成，而被缓慢利用的乳糖，却是产生青霉素的最好碳源。乳糖是有葡萄糖和半乳糖所组成的双糖，并不是合成青霉素的特殊前体，所以乳糖比葡萄糖优越的主要原因是乳糖被缓慢水解成单糖的速度正好符合产黄青霉生产期合成青霉素的需要，而不会产生很高浓度的分解产物来抑制青霉素的合成，因此，碳源的缓慢利用时大量合成青霉素的关键。

38. 乳糖是早年青霉素生产中使用的碳源，在现代工业生产中则采用慢速流加葡萄糖的方法，这样既能促进发酵前期的产生菌生长，又可避免葡萄糖阻遏，从而达到较高的青霉素产量。高浓度的葡萄糖显著阻遏产黄青霉的ACVS和IPNS生成而不抑制它们的活性，而在较小程度上阻遏酰基辅酶A：异青霉素N-酰基转移酶的生成。葡萄糖还导致产黄青霉的乙酰辅酶A合成酶失活，使侧链前体的活化受阻。用葡萄糖培养的菌体的α-氨基己二酸库缩小，这显然是由于刺激了细胞生长和作为赖氨酸生物合成中间体的α-氨基己二酸向赖氨酸转化所造成的。由于葡萄糖比乳糖更有利于真菌的生长，由此可见，青霉素的生物合成阶段需要保持亚适生长条件。乳糖是早年青霉素生产中使用的碳源，在现代工业生产中则采用慢速流加葡萄糖的方法，这样既能促进发酵前期的产生菌生长，又可避免葡萄糖阻遏，从而达到较高的青霉素产量。高浓度的葡萄糖显著阻遏产黄青霉的ACVS和IPNS生成而不抑制它们的活性，而在较小程度上阻遏酰基辅酶A：异青霉素N-酰基转移酶的生成。葡萄糖还导致产黄青霉的乙酰辅酶A合成酶失活，使侧链前体的活化受阻。用葡萄糖培养的菌体的α-氨基己二酸库缩小，这显然是由于刺激了细胞生长和作为赖氨酸生物合成中间体的α-氨基己二酸向赖氨酸转化所造成的。由于葡萄糖比乳糖更有利于真菌的生长，由此可见，青霉素的生物合成阶段需要保持亚适生长条件。 葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率，还由于葡萄糖与6-APA之间形成复合物，从而减少了可用于青霉素合成的中间产物。

39. 葡萄糖效应 所有迅速代谢能源都能阻遏较慢代谢的能源所需酶的合成。酶的生成被易分解碳源所阻遏。此称葡萄糖效应。酶大多数是诱导酶。 葡萄糖效应并不是由葡萄糖直接造成，而是葡萄糖某种分解代谢物引起。cAMP（环腺苷酸）是关键控制因子。其与分解代谢物活化蛋白（CAP）结合，促使RNA多聚酶与启动基因结合而开始转录。 cAMP浓度低时，影响结合，不能转录。 葡萄糖的某种代谢产物降低了cAMP水平，即使有诱导剂存在，也不能合成分解其它糖的酶，只有葡萄糖消耗完，cAMP水平上升，才能开始转录、合成。

40. 流加式操作 流加式操作又称补料－分批式操作（Fed-batch operation），是指在分批式操作的基础上，连续不断补充新培养基，但不取出培养液。由于不断补充新培养基，整个发酵体积与分批式操作相比是在不断增加。 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 。

41. 流加培养优点 实现对发酵过程的控制，如控制代谢途径、菌体比生长速率等，随着菌体的生长，营养物质会不断消耗，加入新培养基，满足了菌体适宜生长的营养要求。既避免了高浓度底物的抑制作用，也防止了后期养分不足而限制菌体的生长。 解除了产物的反馈抑制和葡萄糖效应；避免了前期用于微生物大量生长导致的设备供氧不足；可用于理论研究。不产生微生物的老化变异；产物浓度较高，有利于分离；使用范围广。

42. 控制流加操作的形式有二种，即无反馈控制和反馈控制。控制流加操作的形式有二种，即无反馈控制和反馈控制。 无反馈控制包括定流量和定时间流加，而反馈控制根据反应系中限制性物质的浓度来调节流加速率。青霉素发酵生产中流加操作采用后者，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。 必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或限制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节。

43. pH值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0,因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映 在青霉素发酵中，采用自动化补料工艺，通过控制葡萄糖的补加速率来控制发酵的pH，采用按需补糖方法（根据pH的变化来决定补糖速率），一般在残糖降至 0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖，这样可维持长久的青霉素高产。

44. 溶氧 • 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。 • 氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。

45. 2、氮调控 产黄青霉生物合成青霉素被高浓度的铵离子抑制。这一调控反应和低水平的谷氨酰胺合成酶相关联。在低NH4+浓度下生长的菌丝中，有较高浓度的谷氨酰胺积累，而谷氨酸浓度较低。相反，随着NH4+浓度的增加，谷氨酰胺库减少，而谷氨酸浓度增加，抗生素合成减少。NH4+还直接阻遏产黄青霉的青霉素生物合成基因表达。在用乳糖培养的产黄青霉菌丝中加入40mmol/L NH4Cl，pcbAB和pcbC基因的表达都受到阻遏。现已查明，这种阻遏是通过氮调控蛋白NRE介导的，它能结合到pcbAB和pcbC基因的启动子区，从而影响它们的表达。

46. 3、氨基酸调控 由于青霉素是由三个前体氨基酸生物合成的，因而某些氨基酸必然对这一生物合成过程产生某种调控反应。 在产黄青霉和构巢曲霉的发酵培养基中加入赖氨酸降低青霉素的发酵效价，这一效应物作用于赖氨酸生物合成途径的几个步骤，包括对α-氨基己二酸分支点之前的高柠檬酸合成酶活性的反馈抑制（较大程度）和阻遏（较小程度）及对高顺乌头酸酶的反馈抑制和阻遏，从而减少可用于青霉素生物合成的α-氨基己二酸库。另一方面，赖氨酸在典型的生理浓度下抑制α-氨基己二酸分支点之后的α-氨基己二酸还原酶活性，使细胞内的α-氨基己二酸库增加。低产产黄青霉菌株的α-氨基己二酸还原酶对赖氨酸的抑制不敏感，而高产菌株十分敏感，这是高产菌株何以能够产生更多青霉素的一个重要原因。

47. 缬氨酸作为β-内酰胺抗生素生物合成的前体氨基酸，在胞内保持一定的浓度是必要的，但它反馈抑制本身生物合成途径中的乙酰羟酸合成酶。产黄青霉的乙酰羟酸合成酶对缬氨酸的反馈抑制表现出部分脱敏，从而使得这一前体氨基酸的供应得以增加。缬氨酸作为β-内酰胺抗生素生物合成的前体氨基酸，在胞内保持一定的浓度是必要的，但它反馈抑制本身生物合成途径中的乙酰羟酸合成酶。产黄青霉的乙酰羟酸合成酶对缬氨酸的反馈抑制表现出部分脱敏，从而使得这一前体氨基酸的供应得以增加。

48. 青霉素的生物合成和赖氨酸的 反馈调节 三肽是青霉素生物合成的中间体，除了半胱氨酸和缬氨酸外，还含有α-氨基己二酸。 α-氨基己二酸的初级代谢终产物是赖氨酸，分支的次级代谢产物是青霉素G。所以， α-氨基己二酸是青霉素和赖氨酸的生物合成共同中间体。赖氨酸能反馈抑制赖氨酸生物合成途径中的第一个酶——高柠檬酸合成酶，导致α-氨基己二酸的合成受阻，减少青霉素生物合成中的中间体的供应，使青霉素产量减少。如图一所示

49. α－酮戊二酸＋乙酰CoA 高柠檬酸合成酶 高柠檬酸 顺—高乌头酸 反馈抑制 高异柠檬酸 α－酮已二酸 α－酮已二酸 α－氨基已二酸（α－AAA） L- α -AAA－半胱氨酸 赖氨酸 L- α -AAA－半胱氨酸-D-缬氨酸 图一 青霉素G

50. 4、硫调控 硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸的合成原料，在青霉素的生物合成中起着重要作用，但高浓度的硫酸盐阻遏低产产黄青霉菌株的硫酸盐通透酶而影响其摄取，硫酸盐饥饿条件下的硫酸盐通透酶活性和硫酸盐摄取率均上升。 在高产产黄青霉菌株中，呈现脱阻遏现象，即使在较高的硫酸盐浓度下，仍能具有较高的通透酶活性。