FDNB 法测定氨基酸含量

FDNB法测定氨基酸含量 1、目的要求 2、实验原理 3、试剂与器材 4、实验步骤 5、注意事项 6、思考题吉林大学生物基础实验教学中心

目的要求 • 熟悉色谱仪器的组成及原理 • 了解色谱分离的原理.重点介绍反相色谱柱(以C18为例) • 定量分析的方法(外标法) • 梯度洗脱实验及氨基酸衍生化实验(FDNB法)

实验原理 • 色谱分离的基本原理是不同化合物在色谱柱上的差速迁移导致的色谱分离

实验原理 FDNB法的原理 • 2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）也叫做Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸）

试剂与器材 仪器：四元泵 waters；柱温箱无；紫外可变双波长检测器 2487; 手动进样器; Millennia 工作站色谱柱：Zorbax Exclipse XDB 1504.6 mm 5 mm

试剂与器材 保护柱： XDB C18 4.6x12.5mm Guard fitting Kit 化学试剂：氨基酸标样 250，500，1000 pmol/mL 1% FDNB（大连化物所可购）磷酸二氢钾，碳酸氢钠，氢氧化钾，乙腈，重蒸水辅助品： 2 mL棕色小瓶，pH试纸，恒温水浴箱，溶剂过滤器，样品过滤器，可变量程微量移液器(10-1000 mL)。

实验步骤 衍生化：于2 mL棕色瓶里精确加入30 mL 不同浓度的 AA标样，30 mL 0.5 N NaHCO3 (pH=9)和 1% FDBN 10 mL，于 60C暗处加热 60 min。放置室温，加 1 mL （ 0.01 N, pH=7.0） KH2PO4，摇匀，待HPLC分析。 HPLC 条件：流动相 A ：0.04 N KH2PO4 pH=7.2 流动相B ：乙腈/水=55/45 (v/v) 梯度：B：14% 4 min---10 min/40%----20 min/80%---21 min,100%, 流速：1 mL/min 检测波长：360 nm ；柱温：40C；进样量：10 mL

实验步骤 • 根据得到的数据，求算未知样品浓度 • 完成实验报告

注意事项 1、使用高压灭菌器时，要注意用前的加水。各种灭菌器的使用方法要熟练掌握。 2、紫外线灭菌时，不可在照射时有人在照射区域。 3、化学药品灭菌时，要掌握各种药品的浓度。

思考题 • 为什么要保持反应溶液的碱性环境 • 为什么要对氨基酸进行衍生化处理 • 保护柱的作用是什么 • 反相色谱分离的原理是什么 • 实验中有哪些注意事项

FDNB 法测定氨基酸含量