slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧ PowerPoint Presentation
Download Presentation
ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧ

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 22

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧ - PowerPoint PPT Presentation


  • 122 Views
  • Uploaded on

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA 2 -IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS. Κ ΑΡΑΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΣ Μ ΙΧΑΛΗΣ. Χημικός, Μεταπτυχιακός Φοιτητής Βιοχημείας και Κλινικής Χημείας.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧ' - elsie


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS

ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΣΜΙΧΑΛΗΣ

Χημικός, Μεταπτυχιακός Φοιτητής Βιοχημείας και Κλινικής Χημείας

slide2

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

  • Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη
  • Μοντέλα έκκρισης -Φωσφολιπάση Α2
  • Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA
slide3

SIRS

ΣΗΨΗ

ΛΟΙΜΩΞΗ

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Σύνδρομο Συστημικής Φλεγμονώδους Απόκρισης (SIRS):

Είναι μια συστημική φλεγμονώδης απόκριση σε ποικιλία σοβαρών κλινικών βλαβών (π.χ. οξεία παγκρεατίτιδα, πολλαπλούν τραύμα, εισρόφηση, έγκαυμα).

Λοίμωξη:

Είναι μια φλεγμονώδης απόκριση, που οφείλεται στην παρουσία κάποιου μικροοργανισμού.

ΣΗΨΗ:Πολύπλοκο κλινικό σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από συστημική φλεγμονώδη απόκριση (SIRS) σε συνδυασμό με τοπική ή συστημική λοίμωξη.

slide4

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Μοντέλο σήψης:LPS

  • Βακτηριακός Λιποπολυσακχαρίτης.
  • Βρίσκεται σε αφθονία στο εξωτερικό περίβλημα των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων.

Πηγή: Microbiology, Gary E. Kaiser

  • Λιπίδιο Α: Φωσφολιπίδιο που προκαλεί την παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών. Αποτελεί το ενεργό τμήμα του LPS.
  • Εσωτερικός πυρήνας ολιγοσακχαρίτη: Συνδέεται με το Λιπίδιο Α και λαμβάνει μέρος στην ανάπτυξη αντίστασης σε υδρόφοβα αντιμικροβιακά πεπτίδια.
  • Εξωτερική περιοχή Ο-πολυσακχαρίτη (αντιγόνου-Ο): Είναι η εξωτερική περιοχή του LPS και αποτελεί την αντιγονική περιοχή-στόχο των ανοσολογικών αποκρίσεων των ξενιστών.
slide5

Πηγή: Jpherveg

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

  • Έναρξη σύνθεσης κυτοκινών
  • Σύνδεση LPS με LBP(Lipopolysaccharide-Binding Protein).
  • Σχηματισμός συμπλέγματος LPS-LBP.
  • Σύνδεση με το μόριο του υποδοχέα CD14.
  • Σύνδεση με την πρωτεΐνη MD2 και τον υποδοχέα TLR4.
slide6

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Παραγωγή κυτοκινών

  • Βιοσύνθεση TNF (Tumor Necrosis Factor)
  • Αρχίζει η σύνθεση του TNF από την μεταγραφή του γονιδίου TNF και από τη μετάφραση του TNFmRNA.
  • Φάση του καταρράκτη στη σήψη
  • Με την έκκριση του TNF ενεργοποιείται η έκκριση δευτεροπαθών μεσολαβητών π.χ. IL-1, IL-6, IL-8.

Πηγή: Invivogen

slide7

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

  • Το κλειδί στη σήψη είναι οι κυτοκίνες, που είναι ανοσορρυθμιστικά πεπτίδια παραγόμενα από τον ξενιστή.
  • Κυτοκίνες:
  • Φλεγμονώδεις: TNFa, Φωσφολιπάση Α2, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-15, IFN-γ, πρωτεινική κινάση, CD14, κ.λ.π
  • Αντι-φλεγμονώδεις: IL-1a, IL-4, IL-10, IL-13, ο υποδοχέας της IL-1 τύπου ΙΙ, κ.λ.π.
slide8

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

  • Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη
  • Μοντέλα έκκρισης -Φωσφολιπάση Α2
  • Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA
slide9

Cis-Golgi network

SNARE pair

COPI vesicle

COPII vesicle

Coat protein

1

SNARE protein

SNARE pair

Rough ER

Soluble cargo

Membrane receptor

Membrane cargo

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Εκκριτικά Μονοπάτια

Πηγή: Molecular Cell Biology, Darnell

slide10

Ιδιοσύστατη Οδός Εξωκύτωσης (Constitutive Secretory Pathway): Κυστίδια μεταφοράς εκβλασταίνουν διαρκώς από το δίκτυο trans-Golgi και συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη.

Ρυθμιζόμενη Οδός Εξωκύτωσης (Regulated Secretory Pathway): Μόρια αποθηκευμένα σε εκκριτικά κυστίδια απελευθερώνονται από το κύτταρο μετά από κατάλληλοερέθισμα.

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Τελευταίο στάδιο της εκκριτικής πορείας: Εξωκύτωση

Πηγή: Molecular Biology of the Cell, Alberts

  • Ορμόνες, Νευροδιαβιβαστές, Πεπτικά ένζυμα
slide11

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Φωσφολιπάση Α2:

slide12

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

  • Με βάση τις βιολογικές ιδιότητες και την τοπολογία, κατανέμονται σε:
  • Εκκρινόμενες φωσφολιπάσες Α2 (secretory phospholipases,sPLA2),
  • Κυτοσολικές φωσφολιπάσες Α2 εξαρτώμενες από ιόντα ασβεστίου (cytosolic phospholipases,cPLA2),
  • Ενδοκυττάριες ανεξάρτητες ιόντων ασβεστίου (intracellular phospholipases,iPLA2),
  • PAF- ακετυλυδρολάσες (PAF-acetylhydrolases,PAF-AcH).
slide13

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Εκκρινόμενη Φωσφολιπάση Α2 (Secretory Phospholipase A2-sPLA2):

  • Είναι μικρές, υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες μεγέθους 13-18 kDα, αποτελούμενες από μία πολυπεπτιδική αλυσίδα που περιέχει 5-8 δισουλφιδικούς δεσμούς.
  • Τριτοταγή δομή, ηοποία παρέχει στα ένζυμα αυτά σταθερότητα κατά της πρωτεόλυσης και αντίστασηστη μετουσίωση.
  • Λαμβάνουν μέρος σε μια πληθώρα παθολογικών διαδικασιώνμέσω απελευθέρωσης αραχιδονικού οξέος οδηγώντας έτσι στην παραγωγή φλεγμονωδών λιπιδικών μεσολαβητών όπωςπροσταγλανδίνες, θρομβοξάνια και λευκοτριένια.
slide15

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

sPLA2-IIA

  • Ένζυμο εξαρτώμενο από ιόντα Ca2+.
  • Η αλληλουχία αμινοξέων της ανθρώπινης πρωτεΐνης αποτελείται από 124 αμινοξέα.
  • Έχει εμπλακεί σε φλεγμονώδεις νόσους, σηπτική καταπληξία και Σύνδρομο Οξείας Αναπνευστικής Δυσχέρειας ενηλίκων (ARDS).
  • Τα επίπεδα της sPLA2-IIA που ανιχνεύθηκαν σε BAL Fluid ή κύτταρα θεωρήθηκαν ως δείκτης για τη διάσπαση του επιφανειοδραστικού παράγοντα και συσχέτιση με την εν εξελίξει φλεγμονή.
slide16

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

  • Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη
  • Μοντέλα έκκρισης -Φωσφολιπάση Α2
  • Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA
slide17

Βακτηριοστατικό φίλτρο

  • 2000 rpm, 10 min
  • Lysis Buffer
  • 2000 rpm,10 min

ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

1x106 cells/ τρυβλίο

BAL

ΚΥΤΤΑΡΑ

Μετά από 4 h.

BAL FLUID

  • Έλεγχος Προσκόλλησης
  • Προσθήκη Ενεργοποιητών / Αναστολέων

LPS

  • Πρωτεΐνη(Bradford)
  • SDS-PAGE
  • 2-DElectrophoresis
  • sPLA2-IIA (Western Blotting)
  • Confocal Microscopy

Συλλογή μεscrapper

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Απομόνωση και επεξεργασία του BAL για εργαστηριακές αναλύσεις

slide18

Πηγή: Bioinformatics

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis: SDS-PAGE

Η μετακίνηση των συμπλόκων SDS-πολυπεπτιδίων εξαρτάται μόνο από το μέγεθός τους και επιτυγχάνεται με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος μεταξύ των ηλεκτροδίων.

Πηγή: Bioinformatics

slide19

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών –Western Blotting

Πηγή: Bio-Rad Laboratories

Πηγή: GenScript

Μέθοδος μεταφοράς πρωτεϊνών από gel σε μεμβράνη PVDF για την ανίχνευση της παρουσίας,σχετικής ποσότητας και μοριακού βάρους μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης.

Για την ανίχνευσημιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης, είναι απαραίτητη η χρήση ανοσοχημικών μεθόδων.

slide20

Πηγή: GE Healthcare

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Ηλεκτροφόρηση Διπλής Διάστασης – Two Dimensional Electrophoresis (2-DE)

Πηγή: Mollecular and cellural proteomics

Πηγή: Arabidopsis seed proteome

1η Διάσταση

ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ

2η Διάσταση

ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ

Χρώση του gel

  • Coomassie blue G-250
  • Colloidal Coomassie
  • Silver Nitrate

IPG strips

SDS-PAGE

slide21

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Συνεστιακή ΜικροσκοπίαΣάρωσης Laser - Confocal Laser Scanning Microscopy

Πηγή: Δίκτυο Οριζόντιων Εργαστηρίων Πανεπιστημίου Ιωαννίνων

  • Παράγει με τη μορφή κηλίδων, ξεκάθαρες εικόνες σε αδιαπέραστα από την όραση δείγματα, σε ποικίλα επίπεδα.
  • Και ο φωτισμός και η παρατήρηση είναι περιορισμένα σε ένα σημείο του παρασκευάσματος.
  • Πραγματοποιείται ανίχνευση και στις τρεις διαστάσεις x, y, z.
slide22

Department of Chemistry

Ευχαριστώ για την προσοχή σας!