报告人：陈思 时 间： 2012.12.15

1. Controlling Promoter Strength andRegulation in SaccharomycescerevisiaeUsing Synthetic Hybrid Promoters 报告人：陈思 时 间：2012.12.15

2. 准备知识 杂合启动子由两个模块化元件组成：增强元件（串联重复或结合的上游活化序列, Upstream Promoter Sequence ,UAS）和核心启动子元件(core promoter)。

3. 准备知识——core promoter • PGPD 3-磷酸甘油醛脱氢酶组成启动子，是酵母中表达最强的启动子 • PGAL半乳糖诱导启动子，是一种广泛使用的诱导启动子，半乳糖诱导和葡萄糖抑制表达的比例为1000，通过基因敲除可以使PGAL 受半乳糖独立诱导 • PTEF 翻译延伸因子的启动子 • PCYC细胞色素C相对弱的启动子区域

4. 准备知识——UAS

5. 基本思路 结合核心启动子元件和上游活化序列元件构建可控的合成型启动子，认为UAS元件能够作为合成的转录放大器，并能调控任意启动子的表达

6. 三个工作 • 通过使用串联UAS元件，构建了一系列组成型启动子，从而使PGPD的转录水平提高了2.5倍 • 使用UASGAL元件调控内源启动子的表达，再通过结合其他的UAS元件降低了天然PGAL的抑制能力 • 构建了一系列诱导启动子，调控半乳糖基因的表达，如使用PGAL使得表达能力的范围扩大了50倍，同时转录能力增强了15%

7. 质粒的构建 所有包含表达盒的质粒在转化进入大肠前都进行过测序 p416-TEF-yECitrine被改造为p416-MCS-yECitrine，在yECitrinereporter的5’端插入多克隆位点，使得构造和检测杂合启动子成为可能

8. 实验方式 • 使用PmeIand XbaI将核心启动子PGPD、PGAL、PTEF、PCYC、 PLEUM、PCYC158插入yECitrinereporter的5’端,UASGAL、UASCLB、UASCIT、UASTEF以单独、串联或组合的方式插入，从而构造成杂合启动子 • 在进行半乳糖诱导实验时，yECitrine被lac Z 替换

10. 检测方式 • 使用黄色荧光燃料，在一定条件下过流式细胞仪，测定荧光强度，从而反应表达强度 • β-半乳糖苷酶检测 • qRT-PCR

11. 结论1

12. 结论1

13. 结论2

14. 结论2

15. 结论2

16. 结论2

17. 结论3

18. 结论

19. Thank you!