Schizosaccharomyces pombe

2. Schizosaccharomyces pombe • Schizosaccharomyces pombe (fission yesst) • Oftast einlitna, sem auðveldar að sjá hvort stökkbreyting hefur orðið eða ekki.

3. Myndun þéttlittnis • S.pombe inniheldur langa strngi þéttlittnis á litningsendum, við þráðhaft og á silent mating type svæðum. • Myndun þéttlittnis á þessum stöðum krefst breytinga á litninu sem kallar síðan á tvö histónbindandi prótein, Swi6 sem er homólog við manna og bananaflugu HP1 próteinið, og Chp1

4. RNAi • Þegar slökkt er á genum með RNAi leiðnni er notast við tvíþátta RNA (dsRNA) • Dicer ensím klippir tvíþátta RNAið niður í stuttar raðir (um 22 núkleótíð). • (siRNAs) hlaða sér síðan á prótein flóka sem kallast RISC (RNA induced silancing complex) • Flókinn inni hleldur prótein úr Argonaute/PIWI fjölskyldunni sem sigtar út samsvarandi/samstofna mRNA og óvirkjar þau.

5. RNAi • Þættir sem taka þátt í RNAi leiðinni í öðrum lífverum eru einngi nauðsynlegir í S.pombe, • Úrfelling (deletion) á einhverjum þessara þátta eins og Dicer(dcr1+), Argonaute (ago1+) og RNA háðum RNA pólýmerasa (rdp1+) trufflar myndun þéttlittnis.

6. Stuðningur við kenningar um að RNAi taki þátt í myndun þéttlittnis. • Báðir DNA þættir þráðhafts endurtekninga í S.pombe eru umritaðir og hafa fundist siRNAs sem passa við þráðhafts endurtekningarnar. • Nýlegar tilraunir hafa gefið í skyn að tilbúin (gerð af manna höndum) dsRNA gerð úr hárlykkju cunstruct geti slökkt á hómólóg röðum með því að mynda þéttlitni þar sem RNAi er nauðsynlegt.

7. Í þessar rannsókn er leytast við að svara þeirri lykil spurningu hvernig litill RNA mynduð út frá RNAi leiðinni koma af stað myndun þéttlitnis í fission yeast (klofnings gersvepum).

8. Til að bera kensl á þá þætti sem eru mikilvægir í RNAi stýrðum tengslum við þéttlitnisflóka, var gengið út frá því að þessir þættir myndu virka snemma í myndun þéttlitnis • Væru nauðsynlegir við þéttlitninssérhæfðar histón breytingar. • Chp1 er binst þráðhafts endurtekningum og er nauðsynlegt fyrir methylleringu H3-K9(methyllering á lysin 9) og sem kallar síðan á Swi6.

9. Til að kanna hvort Chp1 tæki þátt í tengslunum milli RNAi og myndun þéttlitnins var notast við TAP ( tandem affinity purification procidure) Gerðir voru stofnar sem framleiddu TAP merkt Chp1 til að bera kensl á þá þætti sem eiga samskipti við Chp1. Mynd 1

12. Nokkrar prótein tegundir af stærðunum 65, 90, 100 og 120 kD voru sérstaklega hreinsluð úr Chp1-TAP stofnum • Mass spectrometry á böndum teknum úr gelinu ásamt prótein mixture báru kensl á 120 og 100 kD böndin sem Chp1, 90 kD sem Ago1 og 65 kD bandið var áður óskylgreint prótein SPBC83.03c sem hópurinn skýrði Tas 3 (targeting complex subunit 3) • Stærðinn á Chp1 böndunum var breytileg milli tilrauna sem gefur til kynna að 100 kD bandið sé niðbrots afurð Chp1

13. http://www.asms.org/whatisms/p4.html

14. Til að komast að því hvort Chp1, Ago1 og Tas3 séu saman í próteinflóka var hannaður S.pombe stofn sem framleiddi flull virk Tas3-TAP prótein. • Affinity purification og mass spectrometry squencing var sýnt fram á að Chp1 og Ago1 tengdust Tas3 Mynd 2 • Hreinsunartilraunir með Chp-TAP og Tas-TAP sýndu fram á að Chp1, Ago1 og Tas3 séu saman í próteinflóka sem hópurinn kallaði RITS.

16. Sýnt hefur verið fram á að Chp1 og Ago1 ásamt annara þátta RNAi leiðarinnar taka þátt í myndun þéttlitnis og þögglun á reporter genum sem sett hafa verið sett inn á þéttlittnis svæðum. • Í stofni þar sem tas3 hafði verið slegið út en innihélt ura4+ reporter gen á innermoste og outermoste þráðhaftsendurtekningasvæðum á litningi 1 var sýnt fram á að þögglun virkaði ekki á þessum reporter genum. Mynd 2 D á svipaðan hátt og þegar slökkt var á sir2,chp1 og ago1 genum.

17. Enn frekar sýndi litnis immunoprecipitation fram á að Tas3 er nauðsynlegt fyrir methylleringu á H3-k9 og • Swi6 staðsetningu á ura4+ geninu sem sett var inn á fyrrgreindum stöðum. Mynd 2 E.

18. litnis immunoprecipitation • Próteinið látið bindast við DNA með formaldehyde. • Litni einangrað • Mótefni, sértæk fyrir próteinið. • Prótein hreinsað af • PCR og greining á DNA • Mynd. www.biolynx.ca/promotions/chipit.html