医学科研中的动物模型

1. 医学科研中的动物模型

2. 介绍小鼠介绍大鼠介绍动物饲养如何制备转基因鼠如何制备基因剔除鼠介绍基因捕获技术介绍小鼠介绍大鼠介绍动物饲养如何制备转基因鼠如何制备基因剔除鼠介绍基因捕获技术

3. 小 鼠MOUSE

4. 小鼠的优势 脊椎动物，哺乳动物 组织细胞的生理结构、功能特征、生化特征与人类相似 其基因组规模（3x109bp）与人类近似，许多染色体区域中的基因以同样的次序排列。 繁殖能力强，生命周期短，易于饲养 小鼠拥有的众多近交系，可在相对均一的遗传背景下展开分析。

5. 小鼠的分类 近交系：近亲交配20代以上，遗传背景非常纯，用途最广。如C57BL/6J, C3H, 129, 615。 封闭群：远交群，非近亲交配，易于饲养，繁殖力强，价格低，避免了近交衰退，但遗传差异稍大。如SWISS mouse, NIH mouse, LACA mouse, ICR mouse, Wistar mouse, New Zealand mouse. 突变系: 小鼠疾病模型，如 NIH-nu/nu, 裸鼠， LACA-Dh/+ 杂合半肢畸形基因. 杂交群：由两个不同的近交系鼠杂交所生的第1代鼠， F1。只能用做实验用，不能作为繁殖用。广为应用。

6. 小鼠的肤色 C57BL: 黑色 BALB/c: 白色 C3H： 野生色 DBA：浅灰色 ICR：白色 小鼠的清洁等级 普通：conventional 清洁：clean 无特定病原体：specific pathogene-free, SPF 无菌： germ-free, GF

7. 一、行为和习性 1.性情温驯，胆小怕惊 小鼠经长期的培育，性情温顺,易于抓取,不会主动咬人,操作起来很方便,是理想的实验动物。当饲养室有人时,小鼠活动受到限制,甚至停止活动,受到惊吓时,小鼠尾巴会挺直并猛力甩动。 2.喜黑暗,昼伏夜动 白天活动较少,夜间十分活跃,其进食,交配,分娩多发生在夜间。有两次活动高峰,一次在傍晚后1-2小时,另一次在黎明前。（尊重小鼠的生活作息，晚上不去打扰，所以动物房一定要按时熄灯。 ） 3.喜群居,非同窝雄鼠好斗 群居小鼠生长发育较快,非同窝雄鼠易发生斗殴,群体中处于优势的雄鼠常将处于劣势者的胡须拔光,自己保留胡须,被称为‘理发师’。

8. 一、行为和习性 4.环境适应性差 小鼠对外界环境反应敏感，适应性差，强光或噪声刺激时，有可能导致哺乳母鼠神经紊乱，发生食仔现象。经高温后，繁殖力下降，温度超过32℃，会造成死亡；温度过低，则影响生殖，且易于发病。 5.喜啃咬 因为小鼠门齿终身生长,生长较快,所以特别喜欢啃咬坚硬物品。 6.寿命 一般2-3年。 7.杂食性 以粮食作物为主,自身能合成维生素C。

9. 二、解剖生理特点 1、外貌特征小鼠面部尖突，嘴脸前有19根触须，耳耸立呈半圆形，眼睛大而鲜红；尾长约与体长相等，有平衡、散热等功能。 2、上下颌各有2个门齿和6个臼齿，门齿不断生长，以经常磨损来维持齿端的长度，保持其恒定。

10. 二、解剖生理特点 3、脾脏有明显的造血功能，骨髓为红骨髓而无黄骨髓，终生造血。 4．小鼠无汗腺，尾有四条明显的血管，尾的腹面有一条动脉，背面有一条静脉，两侧各有一条静脉。尾有散热、平衡、自卫等功能。 5．小鼠胃容量小(1～1.5ml)，功能差，不耐饥饿，肠道较短，盲肠不发达，故以谷物性饲料为主。 6．小鼠的淋巴系统发达，外界刺激可使淋巴系统增生，进而可导致淋巴系统疾病。 7．雄鼠性成熟后，开始分泌雄性激素，副性腺分泌精液，以推动精子运动，与雌鼠交配后10～12小时，在雌鼠阴道口处形成明显的白色阴道栓，阴道栓可防止精液倒流，提高受孕率。

11. 三、生理学特性 1. 小鼠是啮齿类实验动物中最小的动物，生命周期短，易于饲养管理，出生时体重仅约1.5g，哺乳饲养1～1.5个月即可达18～20g，可供实验使用。成熟早,繁殖能力强。 2、体温调节能力差，没有汗腺，仅耳、尾 散热，在21-25℃的环境中生长较快。 3、水分在体内的周转期比其他哺乳动物快，水分半衰期仅1.1天。 4、对维生素E缺乏敏感，可影响受孕率。

12. Numbers you need to remember about mouse 体重：出生时 1 g, 断奶时 8-12 g, 成熟时 30-40 g 断奶（离开母亲，aging at weaning): 21天 妊娠期 （gestation time）：21天 月经周期：4-5天 性成熟期 （age at sexual maturity）: 4 -5周龄的小鼠可以交配 每胎产仔数：6-8只 终生怀胎次数：4-8次 寿命：2年左右 染色体数目： 40

13. 性别鉴定：观察肛门与生殖器之间的距离 雄鼠好斗，不同胎次的雄不能同笼饲养 乳头：胸部3对，腹部3对 肺：左侧1-2叶，右侧4叶 睾丸：未成熟时位于腹内，成熟后降至阴囊内 淋巴系统特比发达，骨髓为红骨髓，终生造血 子宫：双子宫（两个子宫颈），会合于阴道 肝：4 叶 体温：37.4 度 呼吸：118-139 次/min 心率：422-549 次/min 血压： 133-160 mmHg 血量：7.8 ml/ 100 g体重 每日消耗的饲料： 4-8 g 每日的饮水：4-7 ml 每日排尿： 1-3 ml

14. 交配 (mating, breding) 现将1只性成熟的雄鼠放入笼（cage）中，1天后再放入1只性成熟的雌鼠；偶尔也放入2只雌鼠。 不能够先放入雌鼠，再放入雄鼠。 雌鼠分娩前，可以将雄鼠拿开。如果不想让它们继续生仔。 分娩后，偶尔会出现父母亲食幼仔（pups）的情况。 产仔21天之后，须将幼仔（litters）分笼（weaning），雌幼鼠放一笼，雄幼鼠放一笼，且每笼的数目不超过5只。 来自不同亲代的litters中的雌鼠，可以放入一笼；来自不同亲代的litters中的雄鼠，不能放入一笼，以防争斗。

15. 饲养小鼠前做好一些准备工作： 熟悉不同种系小鼠的基本习性，会饲养小鼠。 掌握小鼠的基本生理数据。 掌握小鼠实验的基本操作技巧：抓，灌食，标记，取血，取骨髓，麻醉，给药，样品采集（血、骨髓、尿液、腹腔积液等），小手术，处死。 病理学：组织样本取材，固定，组织化学，免疫组化，病理观察。 细胞学：小鼠组织的原代培养、建系。

16. 大 鼠Rat 大鼠体型小，即经济又易饲养繁殖，手术操作也教为方便，使用大鼠的研究非常普遍。

17. 大鼠的一些特点 • 性情温驯（但比小鼠凶猛），行动迟缓。 • 群居（不如小鼠合群）喜阴暗，昼伏夜动。 • 喜啃咬，雄性不如小鼠好斗。 • 杂食性，更喜肉食，对维生素/氨基酸缺乏敏感，易产生营养缺乏。 • 对环境因素刺激敏感，湿度要求严，湿度﹤40%加上高温，尾部易发生环状坏死症。 • 生长发育，繁殖特性同小鼠。 • 血液呈动态变化 不同的时间采血，不同的方法采血等，都能影响血液成分。 • 没有胆囊，肝分6叶，肝脏再生能力强，肝切除60%-70%后可再生。

18. 采食 饮水

19. 给水： 饮用水应保证连续不断，每周换水3～4次（最好是每天更换新鲜水）。 注意饮水瓶嘴是否有气泡、不出水或漏水的现象。每次换水要连同水瓶和瓶嘴一起换下；并认真清洗水瓶和瓶嘴，然后消毒，严禁未经消毒的水瓶和瓶嘴继续使用。

20. 垫料和笼具的更换： 更换垫料及鼠盒的时间要根据笼内动物的数量环境的湿度而定，一般每周更换垫料和清洗鼠笼1-2次。如遇饮水瓶渗漏应及时更换垫料及鼠盒。 换出的鼠盒要及时清洗，并用消毒液浸泡消毒，晾干后方可使用；垫料及时清理，并作无害化处理。

21. 大鼠的饲养管理 • 大鼠对环境因素的刺激非常敏感。其中温度、湿度的波动或突然变化可成为重要的应激因子，促进条件致病菌所致传染病的爆发。空气干燥，湿度低于时，大鼠易得环尾病。所以特别注意温湿度。 • 肮脏的垫料、笼内过度拥挤或通风不良、环境内产生过量的氨气或硫化氢会引起呼吸道感染。 • 饲喂大鼠要定时定量，每日喂给新鲜水，一般每周换垫料2-3次。 • 大鼠扩大繁殖生产，一般采用一雄多雌间隔同居法，当雌鼠腹部明显增大确认怀孕后，进行单养准备分娩，并投入新的雌鼠。

22. 大鼠的听觉灵敏，对噪声耐受性低，强烈噪音引起吃仔或抽搐现象。饲养间要保持安静。大鼠的听觉灵敏，对噪声耐受性低，强烈噪音引起吃仔或抽搐现象。饲养间要保持安静。 光照对大鼠的生殖生理或繁殖行为影响较大。外界强光，甚至推荐标准范围的光线水平也能引起白化大鼠视网膜变性和白内障。所以在顶层大鼠笼架应装上光线挡板，以防天花板照明装置对大鼠的影响。 总之，大鼠饲养室应做到安静、通风、空气洁净度高。

23. 大鼠喂全价颗粒饲料。饲料应保证其营养需要，并符合各等级动物饲料的卫生质量要求。大鼠喂全价颗粒饲料。饲料应保证其营养需要，并符合各等级动物饲料的卫生质量要求。 大鼠对蛋白质的要求高，特别是动物性蛋白和维生素，投给量要比小鼠多。 大鼠对营养缺乏非常敏感，营养缺乏时常会导致缺乏症，并加剧传染病的发生。

24. IVC饲养系统的操作与管理 • IVC ：individual ventilated cages， 独立换气笼盒 • 每个饲养盒作为一个独立的单元，完全密封，有独立的进出风管道，饲养操作在超净工作台中进行。IVC饲养笼具能确保动物饲养环境达到SPF级、防止交叉感染。 • IVC饲养系统包括三个主要部分：IVC、饲养架和主机，必须匹配超净工作台。 • IVC饲养系统占地面积小、能源消耗低，操作简便。

25. 饲养盒

29. 疾病小鼠模型 自发性小鼠模型——不需要人工干预，自然情况下就有较高的发病频率。如C3H系的乳腺癌。 诱发性小鼠模型——如AOM-DSS 转基因和基因剔除小鼠模型

30. 免疫缺陷鼠 （immunodeficient mouse） Nude mouse （裸鼠）：缺乏T细胞系统 SCID mouse：缺乏T、B细胞系统 Rag-1, 2 knockout mouse：取代SCID小鼠的理想的动物模式

31. Nude mouse （裸鼠）：缺乏T细胞系统 裸鼠的主要特征表现为无毛（Hairless）、裸体（Nacked和无胸腺（Athymus）。 无胸腺，致T细胞生成障碍。 受孕力极低，死亡率高，寿命在15～26周。 遗传背景：FOXN1基因突变 存在“泄漏”的缺陷：有些裸鼠仍可能会有少量的T细胞，特别是年龄大的鼠。 无法完成以下的反应 抗体生成（需要 CD4+ helper T cells ） 细胞介导的免疫反应 （需要 CD4+ and/or CD8+ T cells） 延迟性的高敏反应（需要 CD4+ T cells） 移植排斥反应（需要CD4+ and/or CD8+ T cells） 比较适合进行AIDS、免疫缺陷、肿瘤移植等实验。

32. SCID mouse：缺乏T、B细胞系统 没有成熟的B与T淋巴细胞 遗传背景：SCID基因突变 不能有效的合成免疫球蛋白（Immunoglobulin）与T细胞受体（T cell receptor；TCR） 存在“泄漏”的缺陷：约有2-23%子代具有少量的淋巴样细胞，并产生少量的免疫球蛋白

33. Rag-1, 2 knockout mouse： RAG基因在免疫球蛋白剪辑V（D）J recombination中占重要的角色，因此RAG基因缺陷小鼠，不 产生血清免疫球蛋白，没有正常功能的B与T细胞。 是取代SCID小鼠的理想的动物模式。

34. 基因工程小鼠 转基因动物—— 将目的基因导入受精卵（或早期胚胎干细胞、早期胚胎），并整合到受体细胞的基因组中。受体细胞经过发育形成所有细胞都含有目的基因的个体，并能遗传给后代。简言之，指用实验的方法在染色体基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗传给下一代。 基因剔除（敲除），基因打靶——用分子生物学技术将染色体上的基因去除，或者用其它序列相近的基因将其取代。 在体外培养的小鼠胚胎干细胞中，用含靶基因同源序列载体取代相应的正常基因。

35. 转基因小鼠的实验 分为四步： 载体构建 转基因小鼠的建立和鉴定 转基因小鼠品系的繁育 转基因小鼠的表型鉴定 转基因小鼠

36. 第一步 转基因小鼠的载体构建 启动子：泛表达的，特定组织表达的 内含子：目的基因本事的，或者是商业化载体的 目的基因：一般是cDNA序列 Poly A尾：商业化载体的 转基因小鼠

37. 第一步 转基因小鼠的载体构建 四环素调控的基因表达系统，更加精确地调控基因的表达。 设计两个载体，建立两类转基因小鼠。第一类转基因小鼠导入一个受四环素调控的转录激活蛋白，如rTA(Tet-off系统)。在没有四环素的时候将激活带有TRE（四环素反应元件）DNA序列下游的基因表达。 第二类转基因小鼠是将要表达的目的基因克隆在TRE启动子的下游。当它和第一类小鼠交配后，产生两种转基因都为阳性的小鼠。这类小鼠中目的基因的表达收到体内是否含有四环素的调控。 如果第一类小鼠的载体上还加上一个特异性的启动子序列，则可以使目的基因定时、定点表达。 转基因小鼠

38. 第二步 转基因小鼠的建立和鉴定 • 小鼠受精卵的获得 • 受精卵原核DNA显微注射 • 注射后受精卵的体外培养 • 代孕小鼠输卵管移植 转基因小鼠

39. 第二步 转基因小鼠的建立和鉴定 1. 小鼠受精卵的获得 采用4-5周龄的杂交一代小鼠，利用杂交鼠的生长优势，获得量多、质优的受精卵。 联合注射孕马血清和人绒毛膜促性腺激素，可在一个小鼠中获得30个以上的受精卵。 在雌雄小鼠交配后18-20小时，受精卵取出后需要用透明质酸酶进行适当的消化处理。 转基因小鼠

40. 第二步 转基因小鼠的建立和鉴定 2. DNA原核注射是在倒置显微镜下毛细玻璃针将DNA样品（线性）注入到受精卵的核中。 转基因成功率在5%-40%。大多数情况下，外源基因在染色体上的整合发生在1细胞时期，这时导入的外源基因将存在于小鼠的所有细胞中。但是也有高达30%的情况，转基因在染色体上的整合是发生在受精卵分裂之后，在这种情况下，获得的小鼠是所谓的嵌合体，它的后代转基因阳性的比例会明显下降，甚至消失。 外源基因整合到小鼠染色体是随机的，拷贝数不一定，插入位点不一定，或者是有多个插入位点。 DNA样品的纯度和浓度影响成功率。 转基因小鼠

41. 第二步 转基因小鼠的建立和鉴定 3. 注射后受精卵的体外培养 4. 代孕小鼠输卵管移植 与此同时，同步准备代孕小鼠（受体小鼠）。先将受体母鼠和输精管结扎的雄鼠交配。次日早晨检测是否有阴道栓，有的话，就可以作为受体小鼠，接受受精卵移植。如果一切顺利，幼鼠将在19天之后出生。 转基因小鼠

42. 第三步 转基因小鼠的繁育和品系建立 首建者小鼠，杂合子。与野生型交配，获得阳性后代。 让这些阳性后代（是兄弟姐妹）之间交配，可获得纯合子。 如何判断纯合子与杂合子？ 定量PCR，或者是遗传分析 转基因小鼠

43. 第四步 转基因小鼠的表型鉴定 PCR Southern blot Northern blot Western blot 表型鉴定经常会出现意想不到的情况，需要研究者具有被非常敏锐的观察能力，对基因的功能有很深入的理解，这也是这类研究引人入胜的地方。 转基因小鼠

44. 转基因小鼠

45. 基因剔除小鼠的实验 分为五步： 载体构建 ES细胞的DNA转染和基因剔除阳性细胞克隆的筛选 ES细胞的囊胚注射和胚胎移植 嵌合小鼠及基因剔除杂合子小鼠的获得 纯合小鼠的获得及表现鉴定 基因剔除小鼠

46. 第一步 载体构建 基因剔除小鼠

47. 第一步 载体构建 5’-同源重组臂、neo基因、3’-同源重组臂、tk基因 同源重组臂用于引导打靶载体和染色体上的靶基因发生同源重组。最好不要小于5kb。 Neo基因叫正筛选基因。含有该标志的细胞可以拮抗G418的毒性筛选。 Tk基因叫负筛选基因，它在同源重组臂的外侧。当载体是随机插入到宿主染色体时，tk基因得以表达，使用抗疱疹药物时，细胞会死亡。 到底剔除掉那些外显子？ 基因剔除小鼠

48. 第二步 ES细胞的DNA转染和基因剔除阳性细胞克隆的筛选 载体线性化。 ES细胞的培养是关键（保证其处于未分化状态）。 利用电转移的方式，将载体DNA转染到ES细胞中 进行G418和抗疱疹药物的筛选，挑选出neo+, tk-的ES细胞。 PCR或者Southern blot验证ES细胞克隆是否被成功地转染了，同源重组是否发生了？ 基因剔除小鼠

49. 第三步 ES细胞的囊胚注射和胚胎移植 将筛选出来的ES细胞注射到小鼠的囊胚（受精后3.5天）中。 注射后的囊胚移植到同步化的假孕母鼠子宫中。 这些注射到囊胚中的ES细胞能够随小鼠的发育过程而复制和分化成小鼠各种组织的细胞，从而和囊胚供体小鼠的细胞共同组成嵌合体小鼠。 嵌合体小鼠的组织细胞是由两种来源的细胞构成。 如果嵌合体小鼠的生殖细胞中含有ES细胞来源的生殖细胞，就可以将ES的遗传特征传递给后代。 基因剔除小鼠

50. 第四步 嵌合小鼠及基因剔除杂合子小鼠的获得 ES细胞一般是129品系，主要有灰色和白色皮毛两种。 囊胚通常采用C57小鼠，黑色皮毛。 所以嵌合体小鼠的皮毛应为黑灰或者黑白嵌合皮毛。 ES细胞都是雄性胚胎来源的细胞，因此要选择雄性的嵌合鼠进行繁殖。 嵌合小鼠再与C57小鼠交配，挑选皮毛为灰色或白色的个体。这些小鼠是由ES细胞来源的精子和C57小鼠来源的卵子结合发育而来。它们中间会有基因剔除的杂合子小鼠。 基因剔除小鼠