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青枯雷尔氏菌致病性检测及相关基因分析. 汇报人 ：林海云 指导教师：刘波、关雄、车建美. 汇报内容. 研究背景 研究意义 技术路线 可行性研究 工作小结 后续研究. 一、研究背景. 细菌性青枯病分布和危害 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌（ Ralstonia solanacearum ）引起的毁灭性土传病害，主要分布在热带、亚热带和温带地区，在我国南方各省市均有严重发生。青枯雷尔氏菌可危害44个科的300余种植物。. 青枯雷尔氏菌分类地位 Kingdom ： Bacteria Phylum： Proteobacteria
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青枯雷尔氏菌致病性检测及相关基因分析 汇报人 ：林海云 指导教师：刘波、关雄、车建美
汇报内容 • 研究背景 • 研究意义 • 技术路线 • 可行性研究 • 工作小结 • 后续研究
一、研究背景 • 细菌性青枯病分布和危害 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的毁灭性土传病害，主要分布在热带、亚热带和温带地区，在我国南方各省市均有严重发生。青枯雷尔氏菌可危害44个科的300余种植物。 • 青枯雷尔氏菌分类地位 • Kingdom：Bacteria • Phylum：Proteobacteria • Class：BetaProteobacteria • Oder：Burkholderiales • Family：Burkholderiaceae • Genius：Ralstonia
一、研究背景 • 青枯雷尔氏菌形态特征 菌体形态 呈长椭圆形，近杆状，革兰氏阴性菌，菌体大小为0.5-0.8×1.3-2.2微米，极生鞭毛1-4根，不形成荚膜和芽孢。菌体内均有聚-β-羟基丁酸盐颗粒，在电子显微镜或显微镜下显示两极着色较深的特征。
一、研究背景 • 青枯雷尔氏菌形态特征 • 菌落形态 • 在TTC培养基上，在30℃下划线培养48~72h后，可出现两种菌落形态。
一、研究背景 • 青枯雷尔氏菌检测和鉴定 四氮唑培养基 传统组织 分离 半选择性培养基 酶联免疫吸附法 检测方法 血清学 间接免疫荧光染色法 分子杂交检测法 分子 生物学 PCR扩增技术
一、研究背景 • 青枯雷尔氏菌致病性机制 胞外多糖（EPSI） 堵塞导管，导致导管破裂；移动、扩散和定植；掩盖脂多糖。 胞外蛋白——10种左右，95％ 果胶酶，将果胶质肢解成低聚物并为病菌提供半乳糖醛酸作为生长基质；纤维素酶，通过降解细胞壁上的纤维性葡萄糖，可能对青枯菌入侵植物根部和穿越木质部导管起着一定的作用 Ⅲ型分泌系统及其输出产物(T3S)——hrp基因簇 对细菌搬运毒性因子或非毒性蛋白直接进入植物细胞，促进病原细菌获得营养或抑制寄主防御反应起着作用。
二、研究意义 • 从分子水平揭示青枯雷尔氏菌在致病性的差异 • 找出致病性基因中引起致弱的关键基因 • 提供青枯雷尔氏菌致病性强弱检测新途径 • 提供药物作用靶标位点，为设计新型药物提供依据
菌株筛选 特异性引物鉴定菌株 筛选引物，致病性基因检测 弱化指数测定 生理、生化检测 回接植物 观察致病力 pH 检测 生长曲线 绘制 胞外多糖 检测 三、技术路线 对比
张扬等设计了适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系，并成功克隆了编码青枯菌12个gsp基因。 2002年法国科学家Salanoubat等在自然杂志上发表了青枯菌(GMI1000菌株)的全基因组序列。在GenBank登录号为AL646052。 四、可行性研究 Poussier. S 等用Oligo 5.0软件，设计了11对引物对hrp基因簇整段序列的扩增，并且片段长度从231到2456_bp。
待鉴定菌株 摇瓶培养 形态鉴定 划线 四氮唑培养基 SPA 培养基 分子鉴定 30℃，48~72h Promega试剂盒 30℃ 170rmp/min 14~16h 特异性引物 DNA 提取 PCR扩增 五、工作小结 • 青枯雷尔氏菌鉴定 方法： 纯度检测 504bp
五、工作小结 • 青枯雷尔氏菌鉴定 非青枯雷尔氏菌 弱致病性青枯雷尔氏菌 强致病性青枯雷尔氏菌
不同寄主青枯雷尔氏菌DNA浓度测定结果 不同寄主青枯雷尔氏菌DNA频数分布图 五、工作小结 • 青枯雷尔氏菌基因组DNA提取 非参数分析结果如下：Chi-Square=254.750，df=85，Sig=0.00，说明不同菌株间DNA浓度有极显著的差异，因此有必要对其统一标准化，进行统一换算，以减少后续试验的误差。所以对所提取的DNA换算为终浓度为25ng/μL。
五、工作小结 • 青枯雷尔氏菌的分子鉴定 504bp 504bp 504bp 504bp
五、工作小结 • 青枯雷尔氏菌的鉴定 • 共完成109菌株鉴定，其中85株已鉴定为青枯雷尔氏菌。 • 提取了85株青枯雷尔氏菌DNA，并将其浓度稀释至25ng/μL。
弱化指数计算： • 结果分析运用DPS7.05版数理统计分析软件，采用欧氏距 离法，进行聚类分析。 方法： 五、工作小结 • 弱化指数分析
五、工作小结 • 弱化指数分析 C B A A 强致病性R.solanacearumB过渡区 C弱致病性R.solanacearum
λ=1.095 五、工作小结 • 弱化指数分析 弱化指数0.83~0.75 弱化指数0.83以上 弱化指数小于0.75
五、工作小结 • 弱化指数分析结果小结 根据聚类分析结果可知，共有17株青枯雷尔氏菌弱化指数小于0.75（属于强致病性青枯雷尔氏菌）；有25株青枯雷尔氏菌弱化指数是在0.75~0.83（属于过渡区）；共有20株青枯雷尔氏菌弱化指数大于0.83（属于弱致病性青枯雷尔氏菌）。
PCR程序 94°C5min 94°C30s 63°C30s 72°C1min 72°C10min 25 五、工作小结 • fliC gene检测 方法： DNA提取方法同分子鉴定。 扩增体系 ddw：18.7 μL ； Buffer：2.5 μL； dNTP：0.5 μL； fliC 1：1 μL； fliC 2：1 μL； Taq：0.3 μL； DNA：1 μL
五、工作小结 • 青枯雷尔氏菌fliC gene 检测结果 400bp 400bp 400bp 400bp 400bp
五、工作小结 • 青枯雷尔氏菌fliC gene 检测结果小结 通过Rsol fliC PCR引物扩增条带可以看出，不同致病性强弱的青枯雷尔氏菌都扩增出了400bp大小的条带。这一试验结果说明了fliC gene并不是强致病性青枯雷尔氏菌和弱致病青枯雷尔氏菌基因突变位点。
六、后续研究 继续查阅相关文献，根据所报道的关于青枯雷尔氏菌的致病性基因，设计引物，继续进行基因检测。 hrpC hrpB hrpO hrpN 根据基因检测结果，对所检测的青枯雷尔氏菌进行归类，并进行生理生化测定。
