实验三 血清补体总活性测定 —— CH50 试验

1. 实验三 血清补体总活性测定——CH50试验

2. 补体：一组存在于人和脊椎动物血清中及组织液中具有酶样活性，不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，在正常情况下，血清中的补体大多以无活性酶前体形式存在。补体：一组存在于人和脊椎动物血清中及组织液中具有酶样活性，不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，在正常情况下，血清中的补体大多以无活性酶前体形式存在。

3. 物理性质：不稳定，易受各种理化因素的影响，加热，紫外线照射，机械震荡，酸碱和酒精等因素均可破坏补体。物理性质：不稳定，易受各种理化因素的影响，加热，紫外线照射，机械震荡，酸碱和酒精等因素均可破坏补体。 • 灭活：56℃加热30min即可灭活

4. 补体系统的生物学功能 • （1）溶菌和溶细胞作用：补体系统激活后，在靶细胞表面形成MAC，从而导致靶细胞溶解。 • （2）调理作用：补体激活过程中产生的C3b、C4b、iC3b都是重要的调理素，可结合中性粒细胞或巨噬细胞表面相应受体，因此，在微生物细胞表面发生的补体激活，可促进微生物与吞噬细胞的结合，并被吞噬及杀伤。

5. （3）引起炎症反应：在补体活化过程中产生的炎症介质C3a、C4a、C5a。它们又称为过敏毒素，与相应细胞表面的受体结合，激发细胞脱颗粒，释放组胺之类的血管活性物质，从而增强血管的通透性并刺激内脏平滑肌收缩。C5a还是一种有效的中性粒细胞趋化因子。（3）引起炎症反应：在补体活化过程中产生的炎症介质C3a、C4a、C5a。它们又称为过敏毒素，与相应细胞表面的受体结合，激发细胞脱颗粒，释放组胺之类的血管活性物质，从而增强血管的通透性并刺激内脏平滑肌收缩。C5a还是一种有效的中性粒细胞趋化因子。

6. （4）清除免疫复合物：机制为：①补体与Ig的结合在空间上干扰Fc段之间的作用，抑制新的IC形成或使已形成的IC解离。②循环IC可激活补体，产生的C3b与抗体共价结合。IC借助C3b与表达CR1和CR3的细胞结合而被肝细胞清除。（4）清除免疫复合物：机制为：①补体与Ig的结合在空间上干扰Fc段之间的作用，抑制新的IC形成或使已形成的IC解离。②循环IC可激活补体，产生的C3b与抗体共价结合。IC借助C3b与表达CR1和CR3的细胞结合而被肝细胞清除。

7. （5）免疫调节作用：①C3可参与捕捉固定抗原，使抗原易被APC处理与递呈。②补体可与免疫细胞相互作用，调节细胞的增殖与分化。③参与调节多种免疫细胞的功能。（5）免疫调节作用：①C3可参与捕捉固定抗原，使抗原易被APC处理与递呈。②补体可与免疫细胞相互作用，调节细胞的增殖与分化。③参与调节多种免疫细胞的功能。

8. 补体激活的途径： • 经典途径 • 旁路途径 • MBL途径 相同点：三条途径有共同的末端通路，即形成膜攻击复合物溶解细胞。

9. 1、补体经典途径(classical pathway)：是指以抗原抗体复合物为主要刺激物，使补体固有成分以C1、C4、C2、C3、C5～C9顺序发生酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。

10. 2、替代途径（旁路途径）:是指不经C1、C4、C2活化，而是在B因子、D因子和P因子参与下，直接由C3b与激活物结合启动补体酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。在感染早期可为机体提供有效的防御机制。其激活物是病原微生物等提供接触表面2、替代途径（旁路途径）:是指不经C1、C4、C2活化，而是在B因子、D因子和P因子参与下，直接由C3b与激活物结合启动补体酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。在感染早期可为机体提供有效的防御机制。其激活物是病原微生物等提供接触表面

11. 3、MBL途径：在感染早期，体内分泌甘露聚糖结合凝集素(MBL)和C反应蛋白。MBL与细菌表面的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合形成MASP（MBL相关的丝氨酸蛋白酶），MASP继而水解C4和C2启动后序的酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。激活物（或激活剂）是炎症期产生的蛋白和病原体。3、MBL途径：在感染早期，体内分泌甘露聚糖结合凝集素(MBL)和C反应蛋白。MBL与细菌表面的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合形成MASP（MBL相关的丝氨酸蛋白酶），MASP继而水解C4和C2启动后序的酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。激活物（或激活剂）是炎症期产生的蛋白和病原体。

12. 三条途径的区别见下表

13. 补体的来源、采集 • 实验室常用豚鼠、兔的新鲜血清作为补体的来源。 • 补体的采集：一般选用3-5只健康未妊娠的豚鼠或兔子，以无菌操作采集血液，采集好的血液置4℃冰箱过夜，次日离心分离血清即可分离到补体。

14. 溶血素（抗绵羊红细胞抗体）：是以SRBC作为抗原免疫家兔所得到的兔抗血清，无需进一步提纯，但试验前应先56℃加热30min或者60 ℃3min灭活补体。 • 溶血反应：由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性的结合，在电解质存在时能发生凝集，若再有补体参与，红血球则被溶解。

15. 一、目的要求 • 掌握CH50试验原理。 • 掌握CH50试验方法。

16. 二、实验原理 抗绵羊红细胞抗体（溶血素）与绵羊红细胞结合后可激活补体，导致绵羊红细胞溶解。其溶血程度和补体量成正相关，但非直线相关。以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。 S型曲线在30％～70％之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动会造成溶血程度的较大改变，在50％溶血时最为敏感。故常以50％溶血度作为反应的终点指标，所测补体量较为准确，这一方法称为补体50％溶血实验（CH50）。 50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。

18. 三、材料和试剂 • 巴比妥缓冲液（BB液）、2％绵羊红细胞悬液、溶血素（2U）、被检血清（新鲜豚鼠血清） • 水平离心机、水浴箱、酶标仪等。

19. 四、方法和步骤 1.制备1:20待测血清。 2. 制备50%溶血标准管，随试验一起温育。 1）全溶管：2%SRBC 0.5ml+ ddH2O 2.0ml， 2500rpm 10min,待用 2）50%溶血标准管： 1.25ml全溶管上清+1.25mlBB液，混匀备用

21. 4.将1～10号管所测OD值均和标准管比较，以OD值最接近标准管的那一管定为最高有效反应管，按下面公式计算总补体活性单位：4.将1～10号管所测OD值均和标准管比较，以OD值最接近标准管的那一管定为最高有效反应管，按下面公式计算总补体活性单位： 总补体活性（U/ml）＝血清稀释倍数/引起50％溶血管血清用量

22. 五、注意事项： 1.待测标本应无溶血，无污染。 2.受检血清应新鲜，室温放置不能超过2小时。 3.不能立即送检的要立即分离血清－20℃保存。 4.SRBC、缓冲液应新鲜配制，吸取SRBC时应不断轻摇。 5.配制2％SBC、溶血素时要尽可能标准化和准确。

23. 六、结果及讨论 1.结果报告 2.结果分析 • 补体增高：急性炎症、感染、组织损伤、肿瘤等； • 补体降低：见于补体损耗过多，如急性肾小球肾炎、SLE、RA等自身免疫性疾病活动期，大面积烧伤、大出血，慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。

24. 七、思考题 简述CH50试验的方法学评价。