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1. 南京农业大学 生命科学学院 生物化学技术原理及应用

2. 第九章 蛋白纯化与蛋白分析 1 蛋白纯化与检测 2 酶活力的测定 3 免 疫 分 析 4 蛋白质结构分析 南京农业大学 生命科学学院

3. 第一节 蛋白质纯化 • 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要获得纯化均一的甚至是晶体的的蛋白质样品。如果研究活性蛋白质的生物学功能，还需要蛋白样品应保持它的天然构象。 南京农业大学 生命科学学院

4. 第一节 蛋白质纯化 • 蛋白质分离、纯化的过程和一般原则 • 分离纯化蛋白质，首先要选择一种含目的蛋白丰富的实验材料。一般需要经过前处理、初分级、细分级和结晶四步： • 前处理——细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。 • 粗分级——当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。 • 细分级——是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。 • 结晶——由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。 南京农业大学 生命科学学院

5. 第一节 蛋白质纯化 • 蛋白质纯化的一般方法： • 根据蛋白质分子大小不同的分离方法： • 透析和超滤 • 密度梯度（区带）离心 • 凝胶过滤 • 根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法 ： • 等电点沉淀 • 蛋白质的盐溶和盐析 • 有机溶剂分级分离 • 根据蛋白质电荷不同的分离方法 ： • 电泳 • 离子交换层析 • 等电聚焦 • 根据蛋白质电荷不同的分离方法 ： • 亲和层析法 • 根据吸附性不同的方法： • 吸附层析法 南京农业大学 生命科学学院

6. 第一节 蛋白质纯化 • 蛋白质纯化方法的选择： • 没有一种分离纯化方法可适用于所有物质的分离纯化。一种物质也不可能只采用一种分离纯化方法。所以合理的分离纯化方法是根据目的物的理化性质与生物学性质，依具体实验条件而定。 1. 分离纯化初期使用方法的选择 • 分离纯化的初期，由于提取液中的成分复杂、目的物浓度较稀、与目的物物理化学性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。所以早期分离纯化采用萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。 • 早期分离方法的选择原则是从低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大者为合适，但随着许多新技术的建立，一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化、收率愈高、生化物质的变性危险愈少，因此亲和层析法、纤维素离子交换层析法、等电聚焦等在一定条件下，也用于从粗提取液中分离制备少量目的物。 南京农业大学 生命科学学院

7. 蛋白质纯化方法的选择： 2. 各种分离纯化方法的使用程序 • 生物大分子物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要根据物质的分配系数、相对分子质量大小、离子电荷性质和数量及外加环境条件的差别等因素为基础。 • 每一种方法又都在特定条件下发挥作用，因此，在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。各种分离方法的交叉使用对于除去大量理化性质相近的杂质也较为有效。两种步骤的先后顺序反过来应用也会得到同样效果。在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少步骤、提高效率。 3. 分离后期的保护性措施 • 分离操作后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附、操作过程样品液体的残留、空气的氧化和某些事先无法了解的因素。为了取得足够量的样品，常需加大原材料的用量，并在后期纯化工序中注意保持样品溶液有较高浓度，以防制备物在稀溶液中的变性。有时常加入一些电解质以保护生化物质活性，减少样品溶液在器皿中的残留量。 南京农业大学 生命科学学院

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9. 第一节 蛋白质纯化 • 蛋白质含量的测定： • 蛋白质分离纯化过程中，蛋白质浓度的测定是不可须臾或缺的手段。溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物理化学性质来检测： • 采用物理方法如折射率、比重、紫外线吸收； • 化学方法如凯氏定氮、双缩脲反应、福林-酚反应； • 染色法如氨基黑、考马斯亮蓝染色测定； • 此外还可用荧光激发、氯胺T、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法。 • 上述方法中，紫外吸收法、双缩脲法、福林-酚试剂法、考马斯亮蓝染色法等最为常用，它们操作简单，不需要昂贵的设备。 南京农业大学 生命科学学院

10. 第一节 蛋白质纯化 • 蛋白质纯度的测定： • 常用蛋白纯度检查的方法有; • 高效液相层析法。 • 电泳法。凝胶电泳呈现单一区带，是纯度的一个重要指标，说明样品的荷质比(电荷/质量)是均一的。如果在不同的PH下进行凝胶电泳都是一条区带，则结果更加可靠。SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳法也适用于含有相同亚基的蛋白质的纯度检查。 • 免疫化学法。主要有免疫扩散、各种免疫电泳、放射免疫分析、酶标免疫分析等。 • 生物测定法。利用动物体或动物的离体器官、细胞进行生物效价的测定，这种方法接近动物临床所产生的生物学效应因此实际意义也更大。 • 分光光度法。包括紫外分光光度法和红外光谱法。 南京农业大学 生命科学学院

11. 第二节 酶活力的测定 • 酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，真正的含酶量并不多。所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。 • 酶活力是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。 • 一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，而反应时间通常又很短，尤其是在酶活力很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易准确；反之，产物从无到有（如不纯的酶制剂中内源性产物不计的话），只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故酶活力测定绝大多数是采用测定产物生成速率的方法。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 11

12. 酶活力测定酶活力时通常都附有适当的对照以消除非酶促反应所生成的产物，常用对照有以下几种，可根据具体情况予以选择。酶活力测定酶活力时通常都附有适当的对照以消除非酶促反应所生成的产物，常用对照有以下几种，可根据具体情况予以选择。 • 样品对照。若测定酶活力的样品是粗提取液，属于非常不纯的酶制剂，往往含有所欲测定的产物，也可能在保温时由于内源性底物的旁反应产生相同的产物，这些可通过不加底物单加样品的样品对照予以消除。 • 底物对照。某些酶的底物能自发（非酶促）地分解成所欲测定的产物，可以通过不加样品单加底物的底物对照予以消除。 • 时间对照。若酶制剂不纯（含有产物）和底物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。 在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以根据预实验决定。 测定管中的产物量必须减去对照管中的产物才是真正由酶促反应所生成的产物量。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 12

13. 第二节 酶活力的测定 1. 酶活力测定的方法： • 酶活力测定要符合两个原则： • 在零级反应期测定，即-[s]或[p]与反应时间t成正比， • 反应速度与酶量成线性关系，即 [E]= k(-[s]/ t) = k[p]/ t • 常用的方法有： • 定时法 • 连续检测法 • 平衡法 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 13

14. 1. 酶活力测定的方法 1.1. 定时法: • 测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度 的方法称为定时法。因t1和t2是整个反应历程的两个点，故又称两点法，其中t1一般 取反应开始的时间，在酶反应进行一定时间（t2）后终止反应，如加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等，然后测定底物或产物的变化。 • 这种方法的优点是简单，因最后测定产物时酶反应已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。缺点是如果不用预试验确定，无法了解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保证测定结果的真实性。 • 因此，用定时法测定酶活力时，应先做预试验来确定线性时间，并在线性时间内进行测定，否则，不能用[p]除以t来表示每分钟产生的[p]，并用其计算酶活力单位。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 14

15. 1. 酶活力测定的方法 1.2. 连续监测法: • 连续测定（每15s-1min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。定时法只测定两个时间点，而连续监测法则进行多点连续测定。 • 优点是：可将多点测定结果（[s]或[p]的变化）连接成线，容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。也可在反应曲线的拐点处求出其切线的斜率，即初速度。连续监测法测定的结果通常较定时法高，也较为准确，因前者测定时间较短，而在酶反应的初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶的变性作用等均很小。 • 缺点是：因酶和底物边保温边测定的需要，仪器必须有保温装置，而且产物应是可被直接测定的化合物，且借以测定的特殊性质，必须与底物有明显差别，否则，需加入其它试剂，将其转变成可测物质，但必须专虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是否有影响。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 15

16. 1. 酶活力测定的方法 1.3. 平衡法: • 通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法，或称终点法。因定时法是在酶反应的动态期进行测定，故需终止反应后才能测定，而平衡法则无需，因在平衡期中任何一点进行测定，底物和产物的量都不再变化。 • 用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把[p]或[s] 的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低，不能代表初速度，也不是零级反应的速度。 • 但是与定时法相同，只要待测标本与正常标本在相同条件下反应并测定，亦能以此判断出待测标本酶活力的相对大小。而且，对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 16

17. 第二节 酶活力的测定 2. 酶活力的表示方法： • 酶活力的大小是以酶单位数表示的。所谓酶单位是在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，而速度即指单位时间内反应物的变化量。酶单位一般有三种表示方法。 • 惯用单位: • 60年代前，各种酶活力的表示法或酶单位的定义没有统一的标准，不同酶、 甚至同一种酶不同的测定法可有不同的定义，因此正常范围也相差很大，容易造成混乱，有时甚至直接用测得的物理量，如单位时间的吸光度变化( △A/△t)来表示酶单位。 • katal单位: • 1972年酶学委员会又提出一种新的酶单位katal（简称kat），即在确定的最适反应条件下每秒钟催化一摩尔底物变化所需要的酶量为1kat单位。 1kat = 60×106 IU 1nkat = 0.06IU 1IU = 16.67nkat 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 17

18. 2. 酶活力的表示方法： • 国际单位 : • 1961年国际生化学会酶学委员会建议使用统一的国际单位（IU）。规定一个国际单位（IU）为在实验规定的条件下（如温度为25℃、最适pH、最适底物浓度时），每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量。 • 酶的浓度可以IU/L或IU/mL来表示；当底物为蛋白质、多糖等含有多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键的变化来表示酶单位。如采用物理方法测定，应该在物理量与化学量之间建立对应关系进行换算 。 • 国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶活力。但也有缺点： • 从惯用单位换算成国际单位比较麻烦； • 某些酶作用于Mr不明的大分子底物（如淀粉酶、胃蛋白酶等），采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微摩尔数； • 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时，其结果仍不相同。各国常采用不同的测定温度，如25℃、30℃、37℃等，这也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不同的。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 18

19. 第二节 酶活力的测定 3. Km和Vmax的测定： • 对于符合米氏方程的酶类，通过测定底物浓度对反应速度的影响，可以测定米氏常数Km和最大反应速度Vmax。 • 测定时，首先确定反应的条件，包括温度、pH值、酶浓度等。然后取不同浓度的底物与酶反应，分别测定不同底物浓度下的酶反应速度。然后用双倒数作图法和单倒数作图法等求Km和Vmax。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 19

20. 第二节 酶活力的测定 3. Km和Vmax的测定： 3.1. 双倒数作用法（Lineweaver Burk法） : • 米氏公式 v = Vmax[S] / (Km + [S]) • 改写成 1/v =（Km/Vmax[S]）+ 1/Vmax • 以1/v对1/[S]作图，得到直 线，其纵截距为1/Vmax， 横轴截距为1/-Km，斜率 为Km/Vmax。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 20

21. 3. Km和Vmax的测定： 3.2. 单倒数作图法: • 将米氏公式改写成 [S]/v = [S]/Vmax + Km/Vmax • 以[S]/v对[S]作图。横轴截距为-Km，纵轴截距为Km/Vmax，斜率为1/Vmax。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 21

22. 3. Km和Vmax的测定： 3.2. 伊蒂—霍夫斯第法(Eadie Hofstee法)： • 将米氏公式改写成下式 v = Vmax – Km（v/[S]） • 以v对v/[S]作图，得一直线。斜率为Km， 纵轴截距Vmax，横轴截距Vmax/Km，两者相除，即为Km。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 22

23. 第二节 酶活力的测定 4. 其它动力学数据的测定： • 最适温度测定： • 任何酶反应都有一个最适温度范围。在测定时，只要把其他的反应条件固定，只改变反应温度，通过测定不同温度下的反应速度，以温度为横坐标，以相对酶反应速度（最高反应速度为100%，其余温度下的反应速度除以最高反应速度得出相对酶反应速度）为纵坐标绘图，就可得出反应最适温度。 • 热稳定测定： • 热稳定性试验的测定有二种方法 ： • 在底物浓度、酶浓度、pH等条件不变的条件下，在不同的温度下(一般选在40℃以上的 温度)，测定相同时间内的酶反应速度，计算出不同温度下的相对酶反应速度。 • 在底物浓度、酶浓度、pH值等条件不变的情况下，测定在某一较高温度下不同时间的酶反应速度，以反应时间为横坐标，反应速度为纵坐标，绘出曲线。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 23

24. 第二节 酶活力的测定 4. 其它动力学数据的测定： • 最适温度测定： • 任何酶反应都有一个最适温度范围。在测定时，只要把其他的反应条件固定，只改变反应温度，通过测定不同温度下的反应速度，以温度为横坐标，以相对酶反应速度（最高反应速度为100%，其余温度下的反应速度除以最高反应速度得出相对酶反应速度）为纵坐标绘图，就可得出反应最适温度。 • 热稳定测定： • 热稳定性试验的测定有二种方法 ： • 在底物浓度、酶浓度、pH等条件不变的条件下，在不同的温度下(一般选在40℃以上的 温度)，测定相同时间内的酶反应速度，计算出不同温度下的相对酶反应速度。 • 在底物浓度、酶浓度、pH值等条件不变的情况下，测定在某一较高温度下不同时间的酶反应速度，以反应时间为横坐标，反应速度为纵坐标，绘出曲线。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 24

25. 4. 其它动力学数据的测定： • 最适pH值的测定： • 酶促反应均有其最适pH值。通过测定不同pH条件下酶的反应速度，就可以找出其最适pH值。 测定时，其他条件保持一定，使用不同pH值的缓冲液测定酶的反应速度。然后以pH值为横坐标，相对酶反应速度为纵坐标，绘出曲线，求出最适pH。 • 酶的激活与抑制 • 为了测定激活剂和抑制剂对酶活性的影响，可在一定的条件下于反应液中添加不同量的激活剂或抑制剂，然后分别测定酶反应速度。以激活剂或抑制剂的浓度为横坐标，相对酶反应速度为纵坐标，可绘出酶的激活曲线或抑制曲线。 • 抑制作用有竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制等几种。为了辩别抑制的类型，可以按测定底物浓度对酶反应速度影响的方法将反应分成几组（三组以上），每组的各试管中加入不同浓度的抑制剂，而各组的其他条件均互相对应，分别测定酶反应速度。然后以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标、1/v为纵坐标，把各组的变化曲线画在同一图中，即可从图中辩别出抑制类型。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 25

26. 第三节 免疫分析 • 免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，该法具有很高的选择性和很低的检出限，可以应用于测定各种抗原、半抗原或抗体。 • 免疫分析法可分为荧光免疫法、发光免疫法、酶免疫法及电化学免疫法等非放射免疫法和放射免疫法。 • 放射免疫法的灵敏度最高，达10-12-10-15摩/升，是在待测分析物中加入理化性质、免疫学特性与分析物相同的放射性同位素标记的分析物。将该分析物与特异性抗体结合，用测量放射性的方法，测量并计算结合部分与游离部分的比值，从而确定分析物的量。 • 非放射免疫法是使用荧光基团、化学发光或生物发光组分以及酶作为疫标记。免疫分析法普遍应用于生物化学研究和临床病理检验。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 26

27. 第三节 免疫分析 1. 抗体 • 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。由于不同的抗原与抗体特异结合表现出各种不同的反应，因而抗体有不同的名称，如抗毒素、凝集素、沉淀素、溶血等、溶菌素等。并具有作用于相对应的细胞、组织、毒素、酶等一系列的生物学活性。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 27

28. 1. 抗体 • 单克隆抗体 • 当抗原进入体内，在机体中就会诱导出针对不同抗原决定簇的多种抗体，如果要把这些抗体一一分开，用现有的生物化学或物理化学方法是根本办不到的。1975年科勒和米尔斯坦将小鼠免疫细胞与肿瘤细胞融合，培养出既能迅速生长繁殖又可分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。从而获得针对某一特殊抗原决定簇的单克隆抗体。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 28

29. 1. 抗体 • 抗体的特性： • 结合特异性抗原：抗体与其他免疫球蛋白分子区别，就在于抗体能与相应抗原发生特异性结合，在体内导致生理或病理效应；在体外产生各种直接或间接的可见的抗原抗体结合反应。抗体是靠其分子上的特殊的结合部位与抗原结合的。 • 结合细胞：不同类别的免疫球蛋白，可结合不同种的细胞，产生不同的疚，参与免疫应答。 • 具有抗原性：抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 29

30. 1. 抗体 • 抗体的特性： • 结合特异性抗原：抗体与其他免疫球蛋白分子区别，就在于抗体能与相应抗原发生特异性结合，在体内导致生理或病理效应；在体外产生各种直接或间接的可见的抗原抗体结合反应。抗体是靠其分子上的特殊的结合部位与抗原结合的。 • 结合细胞：不同类别的免疫球蛋白，可结合不同种的细胞，产生不同的疚，参与免疫应答。 • 具有抗原性：抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 30

31. 1. 抗体 • 抗体的制备 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 31

32. 第三节 免疫分析 2. 放射免疫技术 • 放射免疫技术包括： • 放射免疫分析（RIA），免疫放射分析（IRMA）。广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。 • 特点：灵敏度高（10-9-10-15g/L）、特异性强、重复性好等。 • 放射免疫分析（RIA） • 原理是：采用定量的标记抗原（Ag＋）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 32

33. 第三节 免疫分析 2. 放射免疫技术 • 放射免疫分析（RIA） • 测定方法与步骤 • 抗原抗体反应：平衡法 或非平衡法 • 分离结合与游离标记物 • 沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻底，迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作简便，重复性好且经济。 • 放射性测定及数据处理 • 晶体闪烁计数仪（γ射线）或液体闪烁计数仪（β射线）；绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 33

34. 第三节 免疫分析 2. 放射免疫技术 • 免疫放射分析（IRMA） • 基本原理 • 单位点IRMA：利用过量标记 抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。 • 双位点IRMA：先用固相抗体与抗原反应结合，然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物， 洗弃反应液中剩余的标记抗 体，测定固相上的放射性。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 34

35. 2. 放射免疫技术 • 两种放射免疫技术的异同点： • 标记物。在RIA中核素标记抗原，抗原有不同种类，根据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中核素标记抗体，不同抗体标记方法基本相同，且标记抗体的比活度高，提高了分析的灵敏度。 • 反应速率。反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中标记抗体是过量的，所以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单克隆体也能得到满意的结果。 • 反应原理。RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关的直线关系。 • 特异性。在双位点IRMA中，一般均应用针对不同位点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的RIA。 • 检测范围。通常RIA的工作范围为2-3个数量级，而RIMA可达3个数量级以上。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 35

36. 第三节 免疫分析 3. 免疫荧光技术 • 免疫荧光技术是是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。其基本原理为： • 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。 • 荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析（第十章将专题讲述）。可用于检测细胞大小、折散率、粘滞度等，更常用于T细胞亚群等的检测。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 36

37. 第三节 免疫分析 4. 酶免疫技术 • 基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。 • 基本特点： • 标记后保留酶和抗原（抗体）的活性 • 酶促反应专一性，保证特异性 • 底物反应放大作用，提高敏感性 • 酶标试剂保存稳定 • 操作简便，安全易行 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 37

38. 4. 酶免疫技术 • 分类： • 酶免疫组化。用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体。 • 酶免疫测定： • 均相酶免疫测定。利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。 （Ag+Ab-E Ag Ab-E + Ab-E ） • 异相酶免疫测定。基本原理：在抗原抗体反应后，先将抗原抗体复合物与游离的酶标抗体分离，再测定酶标记的复合物催化底物显色的活性，最后推算出样品中抗原的含量。 Ag+Ab-E Ag Ab-E + Ab-E • 液相酶免疫测定。分离剂分离游离的和结合的标记物。 • 分为固相酶免疫测定。固相载体结合酶标复合物，经洗涤去除游离的酶标抗体。如ELISA。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 38

39. 第三节 免疫分析 4. 酶免疫技术 4.1. 主要试剂的制备与要求 • 酶与酶作用底物 • 用于标记酶的要求：酶活性高；标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性；酶催化底物后信号易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响；酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉。 • 常用酶及其底物：辣根过氧化物酶（HRP）；碱性磷酸酶（AP）。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 39

40. 4.1. 主要试剂的制备与要求 • 酶标记抗体或抗原 • 基本要求：酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；抗体特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生产和分离纯化。 • 固相载体 • 基本要求：结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。 • 固相载体的种类与选择 • 塑料制品。材料经济，操作简便，易于自动化，最常用。 • 微颗粒。结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析。 • 膜载体。硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 40

41. 第三节 免疫分析 4. 酶免疫技术 4.2. 酶联免疫吸附试验（ ELISA ） • 基本原理与方法： • 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性。 • 测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 • 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 • 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 41

42. 4.2. 酶联免疫吸附试验（ ELISA ） • 双抗体夹心法 • 特点为：非竞争结合反应；常用于抗原的检测；适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测；所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 42

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44. 4.1. 酶联免疫吸附试验（ ELISA ） • 间接法 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 44

45. 4.1. 酶联免疫吸附试验（ ELISA ） • 竞争法 • 特点： • 用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。 • 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。 • 反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 45

46. 第三节 免疫分析 4.2. 免疫印迹（Western Blot） • 免疫印迹法是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。 • 免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。 • 免疫印迹法亦称酶联免疫电转移印斑法，因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southern-blot相类似，亦被称为Western-blot。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 46

47. 第三节 免疫分析 4.2. 免疫印迹（Western Blot） • 免疫印迹法分三个阶段进行： • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 • 电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流，通电45min转移即可完成。 • 酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDA-PAGE加入的分子量标准，确定各组分的分子量。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 47

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50. 第三节 免疫分析 5. 免疫扩散 • 免疫扩散指抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当两者在比例适当处相遇，发生的沉淀反应，反应的沉淀物因其颗粒较大，在凝胶中不再扩散，形成沉淀带的过程。 • 免疫扩散可分单扩散和双扩散。 • 单向免疫扩散是抗原抗体中一种成分扩散，而另一种成分不扩散； • 双向免疫扩散是二种成分在凝胶内彼此都扩散。根据扩散的方向不同又分。 2014/9/15 南京农业大学 生命科学学院 50