实验十 高等植物总 DNA 的提取和纯化

1. 实验十 高等植物总DNA的提取和纯化

2. 实验目的 • 学习提取、纯化高等植物总DNA的方法，理解其原理。

3. 实验原理 • 植物细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA）称为总DNA。高等植物的DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为CTAB法和SDS法。十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl triethylammonium bromiade, CTAB) 是一种阳离子去污剂，可以有效的裂解植物细胞壁，且与DNA形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。 PVP（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，2-巯基乙醇作为还原剂可以防止酚类的氧化。本适用于提取新鲜植物以及干品、冷冻品的基因组DNA。

4. 实验材料 • 山茶花叶

5. 用具和药品 • 研钵，恒温水浴锅，离心机，1.5ml离心管，移液枪，吸头，琼脂糖电泳系统；2%CTAB（CTAB粉末20g/L、100mmol/L Tris-HCl、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA、6%PVP、2%β-巯基乙醇、PH8.0），氯仿/异戊醇（V/V:24/1），75%乙醇，无水乙醇，RNase，无菌水。

6. 实验步骤 • 1、采集新鲜的山茶花叶，置于−70℃冰箱冷冻几个小时。 • 2、吸水纸吸干叶子表面的水分，去主脉，撕成小片，加少量液氮，在研钵中研磨成粉末。 • 3、将研磨好的材料转入1.5ml离心管中，加入65℃预热的2%CTAB1000μl和β-巯基乙醇20 μl ，轻轻颠倒混匀，65℃水浴30min，期间摇匀2-3次。 • 4、室温下静置10min，10000r/m离心5min。 • 5、取上清液于另一1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀，12000r/m离心10min。重复此步操作1次。 • 6、取上清液于另一1.5ml离心管中，加入上清液体积2/3的−20℃预冷异丙醇，轻轻混匀，直至出现絮状物。−20℃静置10min后，10000r/m离心5min。 • 7、弃去上清液，加入500μl的75%乙醇，清洗DNA，小心弃去上清液。再加入500μl的75%乙醇，重复操作1次。 • 8、再加入500μl无水乙醇，清洗DNA，弃去上清液，倒置干燥DNA。 • 9、加入50μlTE液和2μl RNase，37℃水浴30min。4℃保存备用。

7. 电泳 • 琼脂糖电泳，采用0.8%的琼脂糖，0.5×TBE缓冲液，100V电泳10min，观察电泳谱带。

8. 方法的简析 • 冷冻和研磨，使细胞核破裂 • 加入提取缓冲液，溶解DNA • 氯仿/异戊醇抽提，去除蛋白 • 加入异丙醇，沉淀DNA • 酒精冲洗，去除剩余杂质 • RNase消化，去除RNA • 无菌水溶解，保存DNA

9. 电泳图

10. 作业 • 观察电泳的结果，分析DNA提取的纯度的完整性。 • 做出电泳图