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细胞生物学 实验

细胞生物学 实验. 武汉工业学院 生物学实验教学中心. 目录. 实验一 细胞膜通透性 实验二 线粒体和液泡系的超活染色与观察 实验三 细胞凝集反应 实验四 肝细胞的分离 实验五 植物细胞骨架的光学显微镜观察 实验六 DNA 的细胞化学 ――Feulgen 反应 实验七 植物染色体标本制备和观察 实验八 细胞融合. 实验一　　细胞膜通透性. 实验目的. 了解相对分子质量、脂溶性大小、电解质和非电解质溶液对细胞膜通透性的影响。. 实验原理.

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细胞生物学 实验

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  1. 细胞生物学实验 武汉工业学院 生物学实验教学中心

  2. 目录 • 实验一 细胞膜通透性 • 实验二 线粒体和液泡系的超活染色与观察 • 实验三 细胞凝集反应 • 实验四 肝细胞的分离 • 实验五 植物细胞骨架的光学显微镜观察 • 实验六 DNA的细胞化学――Feulgen反应 • 实验七 植物染色体标本制备和观察 • 实验八 细胞融合

  3. 实验一　　细胞膜通透性

  4. 实验目的 了解相对分子质量、脂溶性大小、电解质和非电解质溶液对细胞膜通透性的影响。

  5. 实验原理 细胞膜具有选择通透性。水分子可以自由通过细胞膜，当细胞处于低渗环境时，水分子大量渗到细胞内，使细胞破裂，发生溶血现象。 细胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，分子进入红血细胞，导致水的摄入，使细胞膨胀、破裂发生溶血。溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子有关有关。相对分子质量大的进入细胞慢，发生溶血所需的时间也长。 非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度很小。碳链越长，脂溶性越大。一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解度之比称为分配系数。

  6. 实验原理 各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。电解质溶液，如NaCl与葡萄糖分子数相等时，NaCl产生的渗透压要大的多。具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比，称为等渗系数。用i来表示： I = 葡萄糖的等渗物质的量浓度/NaCl的等渗物质的量浓度 发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞等渗。

  7. 实验仪器、材料和试剂： （1）仪器、用具：小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、秒表。 （2）材料：含适量阿氏液的鸡血或兔血。 （3）试剂：1mol/L乙二醇水溶液、1mol/L丙三醇水溶液、1mol/L葡萄糖水溶液、3mol/L甲醇、3mol/L乙醇、3mol/L丙醇、1/8mol/L、1/9mol/L、1/10mol/L、1/12mol/L、1/14mol/L葡萄糖水溶液、1/12mol/L、1/13mol/L、1/14mol/L、1/16mol/L、1/18mol/L、1/8mol/LNaCl溶液。

  8. 实验仪器、材料和试剂： 阿氏液（Alsever液）,配方如下： 枸橼酸钠……………………………….0.80g 枸橼酸…………………………………0.325g 葡萄糖…………………………………2.05g 氯化钠…………………………………0.42g H2O ……………加至…………… 100.00ml 混匀溶解后，114.3℃高压灭菌，10min备用。阿氏液即含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它即可做细胞的抗凝剂，又可做细胞的保存液。阿氏液和采血量为1：1，一般在4℃下红细胞可保存2周其活性和特性不变。

  9. 方法与步骤： 1、相对分子质量大小对膜通透性的影响 (1) 在编号的3支试管中分别吸入2ml 1mol/L乙二醇、1mol/L丙三醇、1mol/L葡萄糖高渗液。 (2) 先后分别用吸管滴加两滴血液，混匀。 (3) 观察溶血时间，最长延至10min。 (4) 将实验结果记入以下所示表格中。

  10. 2、脂溶性大小对细胞膜透性的影响 (1) 在编号的3支试管分别加入2ml 3mol/L甲醇、3mol/L乙醇、3mol/L丙醇溶液。 (2) 先后分别用吸管滴加两滴血液，混匀。 (3) 观察溶血时间。 (4) 将实验结果记入以下所示表格中。

  11. 3、电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响3、电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响 (1) 将试管编号，注明溶质名称及物质的量浓度。 (2) 按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液2ml。 (3) 每管各加入2滴血液，混匀。 (4) 室温放置15min，观察发生溶血的浓度，确定等渗浓度。 (5) 按表记录实验结果。 (6) 计算等渗摩尔系数。

  12. 注意事项 1、用0.85% NaCl液代替了Alsver液。用生理盐水能明显延长红细胞的保存时间。 2、发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞等渗。所以要认真观察溶血时间，准确记录实验结果。

  13. 作业 记录实验结果，分析结论，计算葡萄糖与氯化钠等渗摩尔系数 思考题 为什么所有带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散？ 质膜的通透性孔经不会大于0.5-1.0nm，并非所有的物质都能通过。带电的物质通常同水结合形成一个水合的外壳，这不仅增加了它们的分子体积，同时也大大降低了脂溶性，因此带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散。

  14. 知识点 简单扩散的限制因素是物质的脂溶性、分子大小和带电性。 脂溶性:脂溶性越强，通过脂双层膜的速率越快(参下图)。 相对分子质量:相对分子质量小，脂溶性高的分子才能快速扩散。根据实验结果，推测质膜的通透性孔径不会大于0.5～1.0nm，能够扩散的最小分子是水分子。 物质的带电性: 为什么所有带电荷的分子(离子)，不管它多小， 都不能自由扩散? 一般说来，气体分子（如O2、CO2、N2）、小的不带电的极性分子(如尿素、乙醇)、脂溶性的分子等易通过质膜，大的不带电的极性分子（如葡萄糖）和各种带电的极性分子都难以通过质膜。

  15. 实验二　　线粒体和液泡系的超活染色与观察

  16. 实验目的 １、观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态数量与分布； ２、学习一些细胞器的超活染色技术。

  17. 实验原理 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色，但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染二类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶体固定，堆积在细胞内的某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

  18. 实验原理 活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的电化学特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳粒子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是有阴离子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂使用，应选择那些对细胞无毒性或毒性较小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适合，可能是因为它具有溶解在类脂类(卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于细胞吸收。

  19. 实验原理 但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应选择那些或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质)并配成较稀的溶液来使用。詹纳斯绿Ｂ这种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基。 中性红为弱碱性染料，对液泡系(高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，这可能是与液泡系中蛋白质有关。

  20. 实验仪器、材料和试剂 1、仪器、用具：显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、解剖刀、吸管、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。 2、材料：洋葱鳞茎、小白兔或蟾蜍、人口腔上皮细胞 3、试剂： 1）Ringer溶液 氯化钠０.８５g（变温动物用0.65g） 氯化钾０.２５g 氯化钙０.０３g 蒸馏水　　　　 　 1 ００m

  21. 实验仪器、材料和试剂 2）1% 和1/3000中性红溶液： 称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶中于暗处保存。 临用前，取1% 原液1ml加入29ml Ringer溶液,即得1/3000工作液,将其装入棕色瓶中备用。 3）1% 和1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液 称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于5ml Ringer溶液中,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤后（可省略）,即为1%原液。 取1%原液1ml加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,将其装入棕色瓶中备用.最好现配现用,以保持充分的氧化能力。

  22. 方法与步骤 （一）液泡系的活体染色与观察 1、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞的液泡系活体染色观察 1)将蟾蜍处死，剪取胸骨剑突最薄的部分一小块，放入载玻片上1/3000中性红染液滴中，染色5－10分钟。 2)用吸管吸去染液，滴加Ringer液，盖上盖玻片进行观察。 3)在高倍镜下可见软骨细胞为椭圆形，细胞核及核仁清楚可见，在细胞核上方胞质中，有许多被染成玫瑰红色大小不一的泡状体，这一特定区叫“高尔基区”，即液泡系。

  23. 方法与步骤 2、植物细胞液泡的活体染色 1）撕取洋葱鳞茎内表皮，放入载玻片上1/3000中性红染液滴中，染色5－10分钟。 2）用吸管吸去染液，滴加Ringer液，盖上盖玻片进行观察。　 3）可见到被染成砖红色的中央大液泡。

  24. 方法与步骤 （二）线粒体的活体染色与观察 1、动物细胞线粒体活体染色的观察 1）处死蟾蜍，置于解剖盘中，剪开腹腔，取出肝脏，放入培养皿中，用吸管吸取Ringer液，反复冲洗肝脏，洗去血液。 2）将肝脏的一个新鲜切面在一块洁净的载玻片上印片，滴1－2滴1/5000詹纳斯绿B加盖玻片，染色10分种后观察。　 3）镜检：可见肝细胞中的线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状，在细胞核周围分大布特别多。

  25. 方法与步骤 2、植物细胞线粒体的活体染色 1）用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴在干净的载玻片上，用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于染液中，染色10－15分钟。 2）吸去染液，加一滴Ringer液，盖上盖玻片，镜检。在高倍镜下，可见表皮细胞中央被一大液泡占据，细胞核被挤至旁边，线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。 （也可用牙签刮取口腔上皮细胞，观察）

  26. 结果与分析 • 1、简述线粒体詹纳斯绿B活体染色的原理。 • 2、绘出蟾蜍肝细胞示线粒体的形态与分布。

  27. 学生成果 • 洋葱鳞茎内表皮线粒体（07年秋05.1班）

  28. 学生成果 • 蟾蜍肝细胞液泡系（07年秋05.1班）

  29. 学生成果 • 09年秋08生物科学1班

  30. 实验三 细胞凝集反应

  31. 实验原理 细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构,脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被.目前认为:细胞间的联系,细胞的生长和分化,免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关. 凝集素(lectin)是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一结合的蛋白质,它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用.凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接,在细胞间形成”桥”的结果,加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集.

  32. 实验用品 1、土豆块茎. 2、显微镜,粗天平,载玻片,滴管2支,离心管2支. 3、PBS缓冲液 称取NaCl 7.2g,Na2HPO4 1.48g,KH2PO4 0.43g, 加蒸馏水,定容至1000ml,调pH值到7.2. 4、2%的红细胞 以无菌方法抽取兔子静脉血液(加抗凝剂),用生理盐水洗5次,每次2000r/min,离心5min,最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2%红细胞液.

  33. 实验方法 1、称取土豆去皮块茎2g,加10mlPBS缓冲液浸泡2h,浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素. 2、用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞液各一滴,置载玻片上,充分混匀,静置20min后于低倍镜下观察血球凝集现象. 3、以PBS液加2%血细胞液作对照实验.

  34. 实验作业 • 简图表示血细胞凝集原理. • 注: 生理盐水: 0.85%--0.9%NaCl,适用于哺乳动物 0.75%NaCl适用于鸟类和无脊椎动物 0.65% NaCl适用于两栖类 抗凝剂ACD (柠檬酸0.48g ,柠檬酸钠1.32g ,葡萄糖1.47g ,加水至1000ml),每6ml新鲜血液加1mlACD液.

  35. 实验四　 肝细胞的分离

  36. 实验目的 1、了解细胞分离的技术 2、掌握一种肝细胞分离的基本方法,学习细胞消化，细胞计数

  37. 实验原理 EDTA是一种化学螯合剂，它对细胞有一定的解离作用。一些组织，尤其是上皮组织，在生长过程中需Ca2＋和Mg2＋维持组织的完整性，EDTA从细胞生存环境中夺取这些离子，形成螯合物，从而使细胞分离。因此可用EDTA来破坏一些细胞之间的连结，从而达到分离细胞的目的。

  38. 实验材料 小白鼠、鸽肝组织 试剂 hanks液（或PBS）、0.05% EDTA(PH8.0)、10% 甲醛、0.4%苔盼蓝、3.8％NaHCO3、75%酒精 PBS(PH7.4)的配制： NaCl 8.0g KCl 0.2g Na2HPO4 2.9g KH2PO4 0.2g 加水至1000ml；用3.8%NaHCO3调PH

  39. 试剂 消化液使细胞离散成单个细胞的溶液，经常使用的有胰蛋白酶、胶原酶和EDTA（乙二胺四乙酸）。EDTA是一种化学螯合剂，属非酶性消化物，它能吸收组织生存环境中维持其完整性所必需的钙、镁离子，从而使细胞相互分离。常用不含钙、镁离子的BSS或PBS配成0.05％的工作液。EDTA的作用比胰蛋白酶缓和，很少用于单独消化新鲜组织，适于消化传代细胞，多与胰蛋白酶混合（1:1或2:1）使用。

  40. 实验步骤 1、处死动物：用拉颈椎法处死小白鼠（或用乙醚麻醉、处死）。 2、取材： （1）解剖小白鼠，露出其肝脏； （2）用(PBS或hanks)灌注法灌其肝脏，并剪开相关血管，使肝变膨大和发白，以除肝细胞中的血细胞； （3）肝叶置hanks液冲洗一次，剪成1mm3见方数块。 3、消化 取肝组织小块，放入小烧杯中，hanks洗2或3次。浸入5～8倍的0.05%的EDTA消化液中，37℃水浴30分钟，其间要不断用吸管吹打。

  41. 实验步骤 4、过滤 将分散的细胞悬液分别用100目和200目的滤网过滤，以除去较大的组织碎片。（10ml hanks液，冲洗） 5、离心分离 取滤液，配平离心： （1）1000rpm，10分种，去上清液，加hanks液8ml吹打； （2）1000 rpm,3分种，去上清液，加hanks液8ml吹打； （3 ）1000 rpm,1分种，加少许hanks液2ml。 6、镜检 7、固定　10%甲醛

  42. 注意事项 配制液体调试PH值时，要少量多次加入NaHCO3，以免过量偏碱造成不必要的液体浪费 作业 1﹑讨论实验中EDTA对实验的影响 2﹑简述分离肝细胞应注意的事项 3﹑绘肝细胞图

  43. 知识点 EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶液 • EDTA的作用原理是：一些组织，尤其是上皮组织，在生长过程中需Ca2＋和Mg2＋维持组织的完整性，EDTA从细胞生存环境中夺取这些离子，形成螯合物，从而使细胞分离，因此，胰蛋白酶和EDTA混合使用可提高消化效率。EDTA只用于消化传代细胞。EDTA作用不受血清抑制，故消化后需彻底去除，否则会影响细胞生长。 • EDTA•2Na是一种化学螯合剂(商品名为Vorson)，它对细胞有一定的解离作用，并且毒性小，使用方便。常用D-Hanks液配成0.02％EDTA工作液，高压灭菌后使用。

  44. 实验五植物细胞骨架的光学显微镜观察 （考马斯亮蓝R250染色法观察微丝）

  45. 实验目的 1、掌握观察植物细胞内微丝的方法：考马斯亮蓝R250染色法 2、掌握细胞骨架的光镜标本制作方法 3、了解细胞的细胞骨架基本形态

  46. 实验原理 细胞骨架是指细胞质中从横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管（MT）、微丝（MF）、中间丝（IF）。具有支持、运动、物质运输等功能。 观察和研究细胞骨架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技术等方法。 对光镜下细胞骨架的形态学观察，多用1%Triton X-100（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使95%以上的可溶性蛋白质及全部脂质被抽提，固定后用蛋白质染料考马斯亮蓝R250染色，使胞质中微丝得以清晰显见。

  47. 器材与试剂 1、器材：普通光学显微镜、恒温水浴锅、50ml小烧杯、小镊子、盖玻片、载玻片、吸管、吸水纸、擦镜纸 2、材料：新鲜洋葱鳞茎内表皮 3、试剂：6 mmol/L磷酸缓冲液（PH6.8）、1%Triton X-100、3%戊二醛、M缓冲液、0.2%考马斯亮蓝R250染液。 4、试剂配制 （1）6mmol/L (pH6.8)PBS (用NaHCO3调PH) A液：NaH2PO4·2H2O 936mg/1000ml B 液：Na2HPO4·12H2O 2148mg/1000ml

  48. 器材与试剂 4、试剂配制 （2）M缓冲液（ph7.2） 咪唑3.40g、KCL3.73g、MgCl2·6H2O 0.10g、EGTA（乙二醇双醚四乙酸）0.38g、EDTA（乙二胺四乙酸）0.04g、巯基乙醇70ｕl、甘油294.8ml，加蒸馏水至1000ml，用1mol/LHCl调pH至7.2。 （3）1%Triton X-100：Triton X-100 1ml、M缓冲液99ml； （4）3%戊二醛：25%戊二醛12ml 、0.2mol/L PBS 88ml； （5）0.2%考马斯亮蓝R250染液 考马斯亮蓝R250 0.2g、甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。

  49. 内容与方法 1、取材　取洋葱鳞茎内表皮，大小约1 cm2，浸入装有PBS（PH6.8）的小烧杯中，使其下沉，处理5～10分钟。 2、抽提 　吸去PBS，加2ml Triton X-100入小烧杯，置37℃恒温箱处理20分钟。抽提细胞骨架以外的蛋白质，从而使骨架图像更加清晰。 3、冲洗1 　吸去1﹪Triton X-100，用 M缓冲液轻轻洗三次，每次10分钟。M缓冲液有稳定骨架的作用。 4、固定 　加3%戊二醛固定30分钟。

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