Les Micro ARNs r gulent l expression de l epissage alternatif du facteur nPTB durant le d veloppement musculaire

1. Les Micro ARNs r�gulent l�expression de l�epissage alternatif du facteur nPTB durant le d�veloppement musculaire KHALLADI Hayate NOUAR Roqiya

2. INTRODUCTION Les Micro ARNs : Large classe d�ARN non codant pr�sent dans divers organismes . Chez les mammif�res , une centaine de micro ARNs ont �t�s identifi�s , beaucoup d�entre eux sont tissu sp�cifique . Ils sont temporairement r�gul�s dans leurs expression , mais leurs fonctions biologiques sont pas encore connue .

3. INTRODUCTION Epissage des ARNm : M�canisme par lequel les pr�-ARNm perdent leurs s�quences introniques et ne conservent que leurs s�quences exoniques � la fin de la transcription . C�est une des �tapes de maturation des ARNm . C�est un moyen de r�gulation post-transcriptionnel des g�nes qui contribue � la diversification de prot�ines produites dans diff�rents types cellulaires . De multiples Myopathies sont caus�es par une alt�ration de l��pissage alternatif .

4. INTRODUCTION Les facteurs PTB : Deux r�gulateurs sont connu pour contr�ler l��pissage alternatif durant la diff�renciation neuronale et musculaire : -la ��polypyrimidine tract-binding�� (PTB) -et son homologue neuronale (nPTB )

5. INTRODUCTION Ce qu�ils vont essayer de montrer :

6. 1)Les prot�ines nPTB sont pr�sentent dans les cellules C2 C12 myoblastiques mais sont absentes des myotubes diff�renci�s : On a bien formation et maturation des myotubes lors de la phase de diff�rentiation

7. On immunoblot des prot�ines issuent du lysat cellulaire C2 C12 en utisant : -AC anPTB IS 2 (1 , 2) -AC aptb NT AC (3,4 ) Bien que pr�sentent dans la prolif�ration des myoblastes , les prot�ines n PTB sont �limin�s dans les myotubes diff�renci�s et diminu�s pour PTB . IL est donc par cons�quent probable que ces deux paralogues expriment des motifs diff�rent

8. Ceci confirme que la perte de n PTB et la diminution de PTB co�ncide avec le d�but de la diff�rentiation musculaire Mais que pour n PTB une correspondance de son ARNm n�a pas lieu . Donc il est probable qu�il ait un m�canisme de r�pression de la traduction des ARNm de n PTB

9. 2) n PTB contient des MREs (Micro ARN Reponse elements ) conserv�s de mani�re phylog�n�tique pour miR-133 : Donc les n PTB poss�dent bien des MREs conserv�s pour les micro ARNs : miR 133 et miR 1/206 . La r�gion seed d�hybridation qui fait intervenir miR 1/206 est plus faible que celles faisant intervenir miR 133

10. Ceci sugg�re que chaque paire de miR -133 et miR 1/206 sont coexprim�s � partir d�un precurseur transcript commun . Donc les PTB et les n PTB sont les cibles des micro ARNs .

11. L�expression de mir-133 et de mir-1/206 est restreinte aux lign�es cellulaires du muscle .

12. L��volution similaire des deux micro ARNs lors de la diff�rentiation confirme bien qu�ils ont un pr�curseur commun .

13. 3) miR-133 r�prime la traduction de l�ARNm de nPTB � travers deux domaines MREs conserv�s dans l�extr�mit� 3�UTR Construction d�un micro ARN artificiel semblable au miR-133 sauvage, et d�une version mutante de miR-133 portant des points de mutations qui peuvent d�sorganiser l�appariement avec la r�gion seed (contenant les MREs) Transfection de ces micro ARNs dans les myoblastes en prolif�ration Mesure de l�expression de nPTB

14. Diminution de 50% de nPTB pour le miR-133 sauvage Pour miR-133 mutant, on a une tr�s faible diminution de l�expression de nPTB ? cette faible r�pression est due peut-�tre � la possibilit� d�appariement avec les bases restantes non mut�es

15. Pour tester directement si miR-133 peut r�primer la traduction � travers la liaison des MREs de n PTB ? utilisation d�un g�ne rapporteur (celui de la lucif�rase) auquel on ajoute la s�quence 3�UTR enti�re de la nPTB humaine, ou alors une version mut�e de la s�quence 3�UTR sur 2 MREs. Cette version mut�e restaure l�appariement avec la version mut�e de miR-133

16. Utilisation de cellules HEK 293 (n�exprimant pas miR-133 et miR-1/206) Co-transfection dans ces cellules des g�nes rapporteurs avec chaque micro ANR artificiel. Mesure de l�expression de la lucif�rase

17. 4)Le blocage de la fonction de miR-133 durant la diff�renciation de la cellule musculaire augmente l�expression des prot�ines PTB et nPTB, et alt�re l��pissage des exons sp�cifiques au muscle Utilisation d�oligonucl�otides LNA compl�mentaires aux micro ARNs ? blocage de leur fonction Immunoblot: (1) Culture de cellules C2C12 sans milieu de diff�rentiation (2) Cellules C2C12 ayant pouss� dans un milieu de diff�renciation durant 72h (3 � 5) Cellules C2C12 ayant pouss� dans un milieu de diff�renciation et transfect�es avec diff�rents LNAs

18. Evaluation quantitative des changements d�expression de nPTB induits par les diff�rents traitements LNA Normalisation du signal de fluorescence �mis par l�Ac sp�cifique de nPTB

19. R�capitulatif: n PTB pr�sente dans les myoblastes (cellules indiff�renci�es) n PTB absente dans les myotubes (cellules diff�renci�es) miR-133 r�prime l�expression de nPTB durant la diff�renciation des myoblastes n PTB r�prime l�inclusion dans l�ARNm mature de certains exons Si on bloque miR-133, on augmente l�expression de nPTB

20. On va �tudier l�inclusion des exons suivants: - NCAM1 - ITGA7 - CAPN3 exon 6 - MTMR1 - MEF2A exon� On analyse par RT-PCR les lysats des cellules d�crites dans la figure 5 (cellules trait�es avec diff�rents LNA)

21. Confirme ce qui a �t� vu avant: Si bloque l�expression de n PTB/PTB, on augmente l�inclusion des exons r�prim�s par ces prot�ines PTB Si on bloque la fonction des miR-133, on diminue l�inclusion dans l�ARNm mature de ces exons nPTB d�pendants

22. CONCLUSION : Les micro-ARNs peuvent cibler des g�nes dont l�expression peut �tre inad�quate dans un tissu particulier , ou encore des g�nes n�cessaires dans le tissu mais qui doivent �tre temporellement contr�l� durant le d�veloppement (comme n PTB ) . Ainsi , mir-133 joue un r�le cl� dans le contr�le de l��pissage alternatif durant la formation du muscle et la d�finition des propri�t�s des cellules musculaires diff�renci�es .

23. CONCLUSION : L�expression de n PTB est extr�mement sensible � la s�quence de 3�UTR . Durant ces exp�riences on a utilis� la s�quence n PTB 3�UTR enti�re dans la formation du g�ne rapporteur , plut�t que des �l�ments ou fragments isol�es ? Conservation du contexte structurale des domaines MREs dans l�ARN? IL est probable que le silencing caus� par les mi RNA soit coupl� � d�autres m�canismes r�gulant l�expression g�n�tique .

24. CONCLUSION : miR-133 et mir-1/206 sont fortement conserv�s � travers les esp�ces animales . 156 g�nes cibles conserv�s des miR-133 et miR-1/206 . Parmi ces cibles conserv�es , peu de g�nes dans les voies de d�termination du devenir cellulaire . Beaucoup de ces cibles sont de nature structurale ou m�tabolique ou encore des mol�cules de signalisation qui agissent apr�s sp�cification du type cellulaire Ces r�sultats sugg�rent que ces micro ARNs contr�lent l�expression � l�int�rieur d�une lign�e cellulaire �tablie plut�t que l�induction de la lign�e.