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SNP 分析原理方法及其应用

SNP 分析原理方法及其应用. 卢大儒 复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室. 遗传分析内容. 基因组 : 染色体水平 DNA 水平 基因突变 重复 , 缺失 , 倒位 , 重排 甲基化 基因组不稳定 多态性 : SNP STR, CNV. SNPs （ single nucleotide polymorphisms). 概念：指在基因组水平由 单个核苷酸的变异 所引起的 DNA 序列多态性 。它是人类可遗传的变异中 最常见的一种 ，占所有已知多态性的 90% 以上。

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SNP 分析原理方法及其应用

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  1. SNP分析原理方法及其应用 卢大儒 复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室

  2. 遗传分析内容 • 基因组: 染色体水平 DNA水平 基因突变 重复, 缺失, 倒位,重排 甲基化 基因组不稳定 多态性: SNP STR, CNV

  3. SNPs（single nucleotide polymorphisms) • 概念：指在基因组水平由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。 • SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中即有1个，人类30亿碱基中大约有1000万个SNPs。 • 人类一般为二等位基因（Biallelic）。二等位基因有四种不同类型，包括一种转换C>T （G>A）和三种颠换C>A （G>T）、C>G（G>C）、T>A（A>T）。

  4. ...C C AT T G A C... …G G TA A C T G... wt/wt ...C C AT T G A C... …G G T A A C T G... ...C C AT T G A C... …G G TA A C T G... wt/m ...C C GT T G A C... …G G CA A C T G... ...C C GT T G A C... …G G C A A C T G... m/m ...C C GT T G A C... …G G CA A C T G...

  5. DNA序列上单个碱基对的置换、插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化DNA序列上单个碱基对的置换、插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化 突变（Gene Mutation) 单核苷酸多态（SNP） • <0.1% • 生殖细胞或体细胞 • 1-50% • 生殖细胞

  6. SNPs的研究意义 1. SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性）,用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。___ 路标的作用 传统研究策略（表征、蛋白、基因） 逆向遗传学 （表型、基因、蛋白） 基因定位：从400个STR到500KSNP芯片 连锁分析基因诊断

  7. 2.基因多态性与性状表型研究 研究SNPs 本身对机体的影响 生理特征、病理外界环境条件下的千差万别 个体识别，疾病易感; 能力; 性格; 喜好 药物治疗; 环境适应 生物进化，民族区分

  8. SNP的特征 • 1 单核苷酸变异; • 2 常见 2 等位基因变化; • 3 很稳定, 回复突变极低; • 4 普遍存在, 分布广泛, 均匀 • 5 存在SNP高变区域和热点 • 6 功能相关, 温和变; 联合作用 • 7 SNP连锁单倍型, 标签SNP

  9. 2002年人类基因组计划(HGP草图绘制已经成功，功能基因组研究将为疾病的预防，诊断和治疗奠定基础。2002年人类基因组计划(HGP草图绘制已经成功，功能基因组研究将为疾病的预防，诊断和治疗奠定基础。

  10. 从HGP 到HapMap • HapMap计划通过对亚、非、欧裔共269个个体全基因组中基因组序列上常见的多态位点（SNP）进行筛查和分析，构建出整合了人类遗传多态信息的“单体型图”，将为疾病易感性、药物敏感性和人类进化研究提供最基本的信息与分析工具。 HGP让我们有了认识人类的参考图. • HapMap 是我们区别彼此差异的参考图; SNP数量剧增, 150-300-600-1000万; SNP- CNV

  11. 如何筛查和检索SNP? SNP的筛查: 人群的基因组测序 24-50-100人 SNP检索与选择: 数据库检索; 根据目标选择

  12. 拥有自己的基因组图谱 • 随着高通量SNP检测技术和DNA测序技术的发展，拥有个人基因组图谱不是梦！ 1 全基因组测序全基因组 30亿-1万-1000 USD 2 ＳＮＰ芯片　 Affymetrix; Illumina 1000 USD 如何解读是今后长时期问题

  13. SNPs related databases • http://egp.gs.washington.edu/ (NIEHS SNPs Program) • http://snp500cancer.nci.nih.gov/home_1.cfm?CFID=264728&CFTOKEN=86045010 (SNP500Cancer) • http://www.hapmap.org/（HapMap project) • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP (National Center for Biotechnology Information) • http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.html (SNPs database from Japan) • http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/faq/snps.shtml ……

  14. 基因组多态性数据库(SNPs)

  15. SNPs: computational candidates where both alleles were seen in multiple chromosomes • genotypes: high-accuracy assays from various platforms; fast public data release 人类单倍型图谱计划(HapMap) • reference samples: 4 world populations • Nigeria 30 sets of trios(30 both-parent-and-adult- • child trios ) • Japan 45 unrelated individuals • China 45 unrelated individuals • U.S. 30 sets of trios http://www.hapmap.org

  16. SNP selection for Disease-gene Association Studies • Approximately 10 million common variants exist in genome • Testing all for association is impractical today • Can the list be reduced with loss of power? • SNPs in Coding (Amino Acid Changes) • SNPs in other functional regions, i.e. regulatory elements • tagSNPs

  17. TagSNPs • Alleles of SNPs that are close together tend to be inherited together. • A set of associated SNP alleles in a region of a chromosome is called a "haplotype". • Most chromosome regions have only a few common haplotypes (each with a frequency of at least 5%), which account for most of the variation from person to person in a population. • A chromosome region may contain many SNPs, but only a few "tag" SNPs can provide most of the information on the pattern of genetic variation in the region. Haplotype 1 Haplotype 2 Haplotype 3 . The two SNPs in color are sufficient to identify (tag) each of the three haplotyes. For example, if a chromosome has alleles A and T at these two tag SNPs, then it has the first haplotype.

  18. SNPs检测方法 1.理想的检测SNPs的方法 ——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs (1) 灵敏度和准确度的要求 (2) 快速、简便、高通量、自动化 (3) 费用低廉 动脑筋的技术活，有意思，有趣，形式万变; 掌握基本原理,本质不离其中

  19. SNP和突变部分筛选和检测方法 • Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) • Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) • Restriction Endonuclease Fingerprinting (REF) • Dideoxy Fingerprinting (DDF) • Cleavase Fragment Length Polymorphism (CFLP™) • Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) • Heteroduplex Gel Electrophoresis (HTX) • Chemical Cleavage of Mismatches (CCM) • Enzymatic Cleavage of Mismatches (ECM) • RNase Cleavage Assay (NIRCA™) • Direct Sequencing • Chip Technology • Real-time PCR • Mass Spectrometer

  20. SNPs检测方法：原理区分 • 基于杂交方法：ASO, 基因芯片，LNA， HRM， 液相芯片 • 结构，构象：PCR-SSCP, DGGE, CFLP DHPLC, DASH,HRM • 基于酶法： DNA聚合酶,连接酶, RNaseH， • 测 序： 化学识别，酶法 • FRET: Taqman，分子信标，循环探针

  21. SNPs检测方法：检测区分 • 凝胶电泳分析技术 • HPLC分析技术 • 质谱检测技术 • 荧光检测技术：流式，板式 • 固相芯片检测技术 • 试纸条显色

  22. Hybridisation Primer Extension Oligonucleotide Ligation Nuclease Cleavage Taqman SNPlex RFLP Affimetrix Amplifluor Sequencing minisequencing Illumina Massy Assay Gel separation DNA Array Mass spectrometry Plate reader 基因分型原理和方法关系简图 DHPLC

  23. Illumina 1536-plex SNPlex SNPstream TaqMan/ Mass Array Throughout Comparation Illumina Affymetrix 550/500 kSNP

  24. 基于杂交的方法 • 原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。 差异越大，检测的特异性就越好

  25. 寡核苷酸探针特异杂交(ASO) • 设计中包含SNP位置的特异的寡核苷酸顺序, 通过严格控制杂交和洗脱条件, 同时设置对照,进行杂交时将SNP通过ASO杂交区分出来. • 缺点: 杂交条件的严谨; 严格的对照 • 导致: 假阳性,阴性

  26. 提高△Tm • 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、PNA、 LNAs等设计中包含SNP位置的特异的寡核苷酸顺序. 通常20bp中一个碱基的差异会导致Tm值下降5～7.5度,修饰后的Tm值会相差2倍. Tm=2(A+T)+4(G+C) (15-20个bp)

  27. 肽核酸（Peptide nucleic acids，PNA)

  28. PNA是一种核酸类似物，与核酸最主要的区别为其骨架是肽键，而不是核酸的磷酸二酯键骨架，在肽键骨架上连有相应碱基，从而具有以下特征：PNA是一种核酸类似物，与核酸最主要的区别为其骨架是肽键，而不是核酸的磷酸二酯键骨架，在肽键骨架上连有相应碱基，从而具有以下特征： 1、热稳定性 一个PNA碱基杂交体的Tm值的贡献平均高1摄氏度，受盐浓度影响很小。 2、与靶分子高特异性地结合 因为其杂合体Tm值高，受盐浓度很小，因此在低盐浓度的体系中会极大的降低非特异的结合。另外因为一个PNA碱基的错配平均会使其Tm值降低15度,非特异结合很好排除。 3、链挤入 PNA能和挤入含有互补配对碱基区的双链DNA形成三链复合结构，这一特性为其在表达调控以及反义治疗方面提供了较大的应用空间。 4、对核酸酶和蛋白酶均不敏感 这对于在体外应用来说有较大的价值。

  29. 与靶分子高特异性地结合 • Tm值高 • 受盐浓度影响小（低盐浓度的体系） • △Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度） PNA/DNA的非特异结合能很好排除。

  30. LNA(locked nucleic acids) • 其结构是在RNA分子的2′羟基和核糖环的4′碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。 • 特点： 1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合 （构象更利于杂交的稳定） 2.匹配和不匹配的△Tm增加

  31. LNAs是一种合成的核酸类似物,其结构是在RNA分子的2′羟基和核糖环的4′碳原子间连入一个亚甲基的“桥”,由于“桥”的作用使核糖环处于更利于杂交的稳定构象,所以能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合,而这种高的亲和性甚至在有一个错配碱基都会大大降低,因此用此作为探针来检测单核苷酸多态性。

  32. 双链DNA检测 • 高分辨率融解曲线（HRM） • 动态等位基因特异杂交 (dynamic allele-specific hybridization,DASH）

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