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Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot

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Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica DNA footprinting Band shift Transfecção com gene reporter Duplo-híbrido CHIP ( chromatin immunoprecipitation

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Presentation Transcript
slide1

Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA

Northern blot

RT-PCR e Real Time RT-PCR

Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica

DNA footprinting

Band shift

Transfecção com gene reporter

Duplo-híbrido

CHIP (chromatin immunoprecipitation

Técnicas de estudo de expressão gênica em escala genômica

DNA Microarray

Análise de EST (expressed sequence tags)

SAGE (serial analysis of gene expression)

slide3

RNA

A B C

slide5

In Situ Hybridization

In situ hybridization of a Drosophila embryo with probes for even-skipped (red) and hunchback (green).

run on

DNA imobilizado em filtros

F E D C B A

K J I H G L

R S T V X Z

Núcleo de

hepatócito

Núcleo de

cel de rim

Transcrição constitutiva

Transcrição específica

em hepatócitos

Run on
northern blot e nuclear run on indicam regula o p s transcricional

mRNA levels

Epi

Ama

1

68

Núcleos isolados de:

epimastigotas amastigotas

a

a

a

b

b

b

A7

A7

A7

1

3

Northern blot e nuclear run onindicam regulação pós-transcricional

Amastin

Tuzin

slide8

Determinação da vida média de mRNAs de amastina

em amastigotas: 74 min em epimastigotas: 11 min

Tratamento com ActD Extração de RNA Northern blot

slide9

Quantificação da expressão de um mRNA

  • Northern blot
  • Proteção à RNAse
  • Primer extension
  • RT-PCR (?)
  • Real Time PCR
slide10

- RT

+ RT

RT-PCR

slide13

Quantificação de RNA por Real-Time PCR

Detecção de fluorescência

gerada em cada ciclo

de amplificação:

- SYBR green

- Primers fluorescentes

estudo de promotores a t cnica de band shift eletrophoretic mobility shift assay emsa
Estudo de promotores: a técnica de band-shiftEletrophoretic Mobility Shift Assay EMSA

DNA + proteína

gel não desnaturante

slide18

Estudos de expressão de mRNA em escala genômica:

High throughput analysis

  • Microarrays
    • cDNAs
    • Oligos
    • Gene chips (Affymetrix)
  • ESTs
  • SAGE
slide19

Estudos de expressão de mRNA em

escala genômica:DNA Microarray

slide20

Análises de EST

  • Single-pass sequencing of “random” cDNAs
    • Somente sequencias do 5’ ou 3’
    • Sequências de baixa qualidade
  • ESTs são cDNAs
    • Representam mRNAs
    • Correspondem a regiões transcritas do genoma
    • Uso de bibliotecas normalizadas e não-normalizadas
slide21

SAGE: Serial Analysis of Gene Expression

Schematic illustration of the SAGE process. (A) Poly(A +)RNA is extracted and transcribed into double-stranded cDNA, primed by biotinylated oligo (dT) (black circles), and digested with the Anchoring Enzyme. (B) The 3-most fragments are isolated by binding them to streptavidin beads (gray ellipses). (C) The fragments are divided and ligated to different linkers (L1, L2). (D) The isolated linker-tags are blunt-ended. (E) The linker-tags

are ligated to linker-ditag-linker constructs and amplified by PCR (E). (F) The ditags are isolated, ligated to concatamers, cloned, and sequenced.

duplo h brido em levedura

b-Gal

GENE REPORTER

Duplo-híbrido em levedura

GENE REPORTER

duplo h brido em levedura1

Transformação

com biblioteca

de expressão

Duplo-híbrido em levedura

Co-transformação

de leveduras his-

- Detecção de colônias azuis

- Crescimento em meio sem his

slide26

Hybridize to DNA chip with

6361 spots, representing all

the known intergenic

regions in the yeast genome.

Average size of the spotted

PCR = 480 bp

Yeast genome/proteome database:

12Mb ~6000 genes

(50% with assigned function)

10% involved in transcription

141 with their activity tested:

myc-tagging

Anti-Myc

slide27

CHIP e

Microarray

podem identificar

todos os genes

regulados

por um mesmo

fator de

transcrição

6361 spots, representing all of the known intergenic

regions in the yeast genome. (average size = 480 bp)

estudo da regula o da tradu o

Polissomos

Monossomos

e subunidades

ribossomais

Frações contendo mRNA associado

a polissomos cada vez maiores

Marcação de cDNA e hibridização

Estudo da regulação da tradução

Uso de Microarray

para identificação

de genes associados

a polissomos