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植 物 生 理 学

植 物 生 理 学. 实 验. 制作 ：张立庆、罗红艺. 目 录. 1. 植物组织水势的测定 2. 质壁分离法测定植物细胞的渗透势 3. 钾离子对气孔开度的影响 4. 根系活力的测定 5. 植物组织中全磷含量的测定 6. 硝态氮含量的测定 7. 叶绿体色素的提取、分离 8. 叶绿体色素的理化性质 9. 光合强度的测定 10. 呼吸强度的测定. 目 录. 11. 过氧化物酶活性的测定

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  1. 植 物 生 理 学 实 验 制作：张立庆、罗红艺

  2. 目 录 1.植物组织水势的测定 2. 质壁分离法测定植物细胞的渗透势 3. 钾离子对气孔开度的影响 4. 根系活力的测定 5. 植物组织中全磷含量的测定 6. 硝态氮含量的测定 7. 叶绿体色素的提取、分离 8. 叶绿体色素的理化性质 9. 光合强度的测定 10. 呼吸强度的测定

  3. 目 录 11. 过氧化物酶活性的测定 12. 植物组织中还原糖含量的测定 13. 植物蛋白质含量的测定 14. 吲哚乙酸含量的测定 15. 吲哚乙酸氧化酶活性的测定 16. 赤霉素对a-淀粉酶的诱导形成 17. 种子生活力的快速测定 18. 油料种子萌发时脂肪酸的变化 19. 不良环境对植物的伤害 20. 植物缺水程度的鉴定

  4. 实验一 植物组织水势的测定 一.实验目的 掌握植物组织水势的测定方法，通过实验进一步了解渗透系统中水势的大小是水分移动方向的决定因素。 二.原理 水势表示水分的化学势，植物体细胞与细胞之间，组织与组织之 间，植物体与环境之间的水分移动方向都是由二者的水势差决定的，水总是由水势高的区域向水势低的区域移动。 当植物组织与外界溶液接触时，如果植物组织的水势低于外界溶液的水势，植物细胞吸水而使外界溶液的浓度变大；反之，植物组织失水而使外界溶液变小；若二者相等，外界溶液浓度不变，此时外界溶液的渗透势等于植物组织的水势。同一种溶液的浓度不同其比重也不同，当两个不同浓度的溶液相遇时（在指示剂的作用下），稀的溶液由于比重小而上浮；较浓的溶液由于比重大而下沉。当把浸过植物组织的溶液滴回到原浓度溶液中时，会发生滴液上浮、下沉和基本不动的三种现象。若滴液不上下移动，则表示溶液的渗透势等于植物组织的水势。此溶液即为等渗溶液，根据其等渗浓度可计算出该溶液的渗透势，即等于植物组织的水势。

  5. 三、操作步骤 1. 取5个小瓶，编号，分别加入0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L蔗糖溶液2ml,盖上瓶塞,作为实 验组,备用。 2.另取5只带贝塞试管，按实验组顺序编号，分别加入以上不同浓度的蔗糖溶液8-10ml，塞上贝 塞，作为对照 组，备用。 3.取植物叶片，避开中脉，用打孔器(将叶片置橡皮塞上)打50片直径为1cm的小圆片，立即依次向 实验组各小瓶中放入10片小圆片，盖上瓶塞，放置30min，其间轻轻摇动小瓶几次(注意切勿让 小圆片沾到瓶壁上，始终让小圆片浸泡在溶液中)。30min后，向各小瓶滴加1-2滴甲基蓝试剂 (注意滴数一致)。 4.用注射器(一种浓度一只)从实验组各小瓶中依次吸取蓝色溶液少许，然后伸入对照组相同编号 的试管溶液的中部，轻轻放出一滴蓝色溶液，观察小液流移动的方向。记下等渗溶液浓度。 四.结果记录及计算 1.记录： 蔗糖溶液浓度（mol/L） 小液流移动方向 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 2.结果计算 根据公式计算溶液的渗透势表示植物组织的水势： φw=-iRCT φw--表示植物组织的水势，用Mpa表示 i---为溶液的等渗系数(蔗糖等渗系数为1) R---为气体常数，R=0.008314MPaL-1mol-1K-1 C---为小液流上下不动的蔗糖浓度(molL-1；等渗浓度) T---为绝对温度，T=273+t，t为室温(℃)

  6. 实验二 质壁分离法测定植物细胞的渗透势 一.原理 植物细胞与外界溶液组成的渗透体系在恒温、恒压 条件下，整个体系的水势由植物细胞的水势和和溶液的渗透势组成，它们之间的差为Δφ=φs-φw,(φs为溶液的渗透势,φw植物组织的水势)，如果二者达到平衡，则φs=φw。也就是说，植物组织的水势等于溶液的渗透势。 植物细胞的水势由φs、φp和φm组成，它们之间的关系为： φw=φs+φp+φm 当植物细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，并处在初始质壁分离时，这时φp近似等于零，当植物细胞的细胞壁等衬质被水饱和时，其φm很小，可以忽略不记，这时上式可写成：φw≈φs，所以，当植物细胞与周围溶液处于渗透平衡状态，而且在细胞处于初始质壁分离时，细胞的水势主要由φs组成，此时细胞液的渗透势就等于溶液的渗透势。 当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离浓度之间的溶液浓度，将等渗浓度代入公式可以计算出细胞的渗透势。

  7. 二.操作步骤 1.溶液配制： 先配制1mol/L的蔗糖母液，再稀释成0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60 mol/L溶液，备用。 2. 选有色素的植物组织(一般选用洋葱鳞片的外表皮)。用镊子取下表皮，迅速分别放入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入溶液，放置10-15分钟。依次取出不同 浓度的蔗糖溶液中的植物表皮薄片，放在滴有相同浓度蔗糖溶液的载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察所有细胞产生质壁分离的情况，并记下质壁分离的相对程度。 3. 在实验中确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离(初始质壁分离)的浓度和不引起质壁分离的最高浓度。 4. 用新的溶液和新鲜的材料重复实验观察几次，直到有确定的结果为止。在此条件下，细胞的渗透势于上述两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等的结果记录于下表：

  8. （作图表示） 蔗糖浓度(1mol/L) 渗透势(MPa) 质壁分离的相对浓度 0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 三.结果计算 测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值（C）后，按实验1中的公式φS =iRCT计算溶液的渗透势或植物组织的渗透势(或水势)。 四.实验作业 1.试述细胞渗透作用的原理。

  9. 实验三 钾离子对气孔开度的影响 一.实验目的 了解钾离子在气孔张开中的调节作用,理解气孔开闭的机理。 二.原理 保卫细胞的渗透系统可由钾离子所调节，无论是环式光合磷酸化或非环式光合磷酸化，都可以产生ATP。ATP不断供给保卫细胞原生质膜上的K+—H+交换泵作功，支持保卫细胞逆浓度差从周围表皮细胞吸收钾离子，降低保卫细胞的渗透势，保卫细胞吸水，膨压增大，气孔张开。

  10. 钾离子对气孔开度的影响 三.操作步骤 1.取三个培养皿，分别放入0.5%的KNO3、0.5%NaNO3 和蒸馏水各10-15ml。 2.取植物叶片表皮若干片放入上述3个培养皿中。 3.将培养皿置25℃温箱中(使溶液温度达到25℃)。 4.将培养皿置于人工光照条件或太阳光下照光30min。 5.分别在显微镜下观察气孔的开度。 四.实验作业 1.记录各处理气孔的开放数和开度。 2.比较在何种溶液中气孔的开度最大， 为什么？

  11. 实验四 植物根系活力的测定 植物根系的生理作用主要有： 1.对地上部的支持和固定。 2.物质的贮藏。 3.对水分和矿质元素的吸收。 4.合成氨基酸；激素等物质。 因此，根系活力是鉴定植物生长状况的重要指标之一。 一、原理 测定方法有TTC法和α-萘胺氧化法。α-萘胺氧化法的本质是过氧化物酶(POD)催化作用，生成红色的α-羟基-1-萘胺，POD活性越强，对α-萘胺的氧化力也越 强。植物的根系能氧化吸附在根表面的α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-萘胺，沉淀于根的表面，使根之染成红色。根系活力愈强染色愈深(定性观察)。

  12. 植物根系活力的测定 也可以测定溶液中被氧化的α-萘胺量，来表示根系活力的大小。α-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，通过比色测定α-萘胺含量。 α-萘胺氧化反应如下： NH2 NH2 [O] OH α-萘胺 α-羟基 -1- 萘胺(红色)

  13. 植物根系活力的测定 SO3H SO3H + 2H+ + NO-2 +2H2O NH2 N+≡N 对氨基苯磺酸 重氮化合物 α-萘胺+重氮化合物HO3S N=N NH2 对苯磺酸-偶氮- α-萘胺

  14. 二.操作步骤 1.样品处理 ⑴.称取2-3g洗净的根系，吸干根表面的水分，放入100ml的三角瓶中，并加入10ml 50ug/ml的α-萘胺溶液和10ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）,浸没根系，静置10min。 ⑵. 取2ml上述根系处理液，测定α-萘胺含量(测定方法见步骤2)，作为实验开始时的α-萘胺初始浓度，作起始值。将三角瓶置25℃恒温箱中反应30分钟，再取2ml反应液测定α-萘胺含量，作终止值。同时按上述方法做一对照（不放根），作为α-萘胺自动氧化量。 2.α-萘胺浓度测定 取2ml处理液于50ml容量瓶中，加20ml蒸馏水、1%对氨基苯磺溶液2ml和0.1g/L亚硝酸钠溶液2ml，在室温放置5min，待溶液显红色后，用蒸馏水定容至50ml，在20-60min内，于波长510nm处测定吸光度，记下OD。 三.结果计算 以α-萘胺氧化强度表示根系活力（ug·g-1·h-1），计算公式如下： 根系活力(ug·g-1Fw·h-1)= ×N 式中：A--α-萘胺氧化量(ug/ml) B--α-萘胺自动氧化量(ug/ml) A - B w(g)×t(h)

  15. 实验五 植物组织中全磷含量的测定 一.原理  磷是植物生长必需的三要素之一，磷被植物吸收进入植物体后，大部分转化为有机物，如糖类(G-6-P、磷酸甘油酸等)、磷脂、核甘酸和核酸等，有一部分仍保持无机物形式。植物体内的磷可分为可溶性磷和不溶性磷。植物样品在强酸高温消化时，使不溶性磷酸盐装化为正磷酸状态进入溶液，同时高氯酸是一种强氧化剂，能使有机磷转化为正磷酸盐而进入溶液。磷酸根离子在酸性溶液中与钼锑抗混合显色剂反应生成黄色锑磷钼杂多酸络合物，被还原剂(如抗坏血酸、氯化亚锡、亚硫酸铁胺等)还原成磷钼蓝，在一定范围内磷钼蓝颜色的深浅于磷酸根的含量成正比，其最大吸收峰在660nm处，故可以用比色法测定无机磷的含量。

  16. 二.操作步骤 1.取通过100目筛的风干或烘干的样品100mg（精确到0.0001）于50ml三角瓶中，用数滴蒸馏水湿润后，加入浓H2SO4 3ml摇匀，加HOCl48-10滴混 匀，在瓶口上放一弯颈小漏斗，置于电炉上加热消化(在通风橱内进行)待三角瓶中溶液开始转白或灰白色时表明消化完全，取下三角瓶冷却(室温下冷却)。 2.待溶液冷却后，用蒸馏水小心转入50ml容量瓶中(冲洗时用蒸馏水应少量多次)，用蒸馏水定容。同时另作一空白对照，除不加样品外，其余步骤与样品相同。 3.吸取待测液5ml于50ml容量瓶中，加蒸馏水25ml、2.6-二硝基酚指示1 滴、滴加4N的HaOH使待测液成黄色，再加2N的H2SO4 1-4滴，使待测液黄色刚刚退去，加钼锑抗混合显色剂5ml，用蒸馏水定容，30min后于波长660nm处比色，记下光密度值。 三. 结果计算 磷含量(%)= ×100 式中：C---从标准曲线上查得的P2O5的浓度（单位ug/ml） 106---将微克换算成克 100---换算成百分数 分取倍数：消化液定容体积 / 吸取消化液体积(ml) C×比色溶液体积×分取倍数 样品重×106

  17. 实验六 硝态氮含量的测定 氮是植物的三大要素之一，大多数植物，尤其是陆生植物最主要的氮源是硝态氮。植物从土壤中吸收硝酸盐，一部分在根内被还原为氨，再转变为有机含氮化合物(氨基酸或酰氨)向植物地上部分运输，其余部分则运到叶片中再还原。植物体内硝酸盐的含量能反映出土壤中硝态氮的供应情况，因此可作为对土壤施肥的指标。 一、原理 植物中的硝酸盐可以用1%醋酸溶液提取，在PH5.6的条件下，用锌粉将硝酸根还原为亚硝酸根。亚硝酸根在酸性条件下与磺胺和-萘胺反应，生成玫瑰红色的偶氮化合物，其颜色的深浅与硝态氮的含量在一定范围内呈线性关系。主要化学反应如下：

  18. 硝态氮含量的测定 + NH2 N≡N + NO2- 磺胺 重氮盐 N≡NNH2 重氮盐 α-萘胺 偶氮化合物 HCl SO2NH2 SO2NH2 + + H2HO2S N＝N NH2 SO2NH2

  19. 二、操作步骤 1. 材料处理 取去中脉的植物叶片0.5g，剪成1-2mm长的碎片，置100ml的三角瓶中，加入1%醋酸溶液20ml，使叶片全部浸入溶液中，振荡或不断摇动20min。取浸出液2ml于试管中，加2 ml 1%的醋酸溶液，再加0.8mol/L醋酸钠溶液4ml，加入20mg锌粉，不断摇动20 min，过滤至干燥试管中。备用。 2.硝态氮含量的测定 取过滤液4 ml于一干燥试管中，加入1 ml α-萘胺-磺胺试剂，摇匀，10min后，于波长540nm处测定光密度， 3. 叶片中原已存在的NO2-含量的测定 取2ml叶片浸出液，除不加锌粉外，其它步骤按方上述方法进行。 三、结果计算 根据以下公式计算植物叶片中硝态氮的含量： A(ug NO3-/gFw)=(C1－C2) ×N 式中：A--为每g植物组织中硝态氮的含量(ug NO3-/gFw)。 C1--为叶片浸提液中NO2-和NO3-的总和(ug/ml)。 C2--为叶片浸提液中NO2-的含量(ug/ml)。 N--为稀释倍数。

  20. 实验七 叶绿体色素的提取和分离 一、原理 高等植物中主要有叶绿素(chla，chlb)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)两大类。它们与类囊体膜相结合，构成色素蛋白复合体。叶绿体色素不溶于水而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析分离。即根据它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，用适当的溶剂推动时，叶绿体色素中各种成分在两相(固定相和流动相)间由于具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一段时间后，可将各种色素彼此分离开。

  21. 二、操作步骤 1.叶绿体色素的提取 ⑴.取新鲜植物叶片洗净，擦干，去中脉，称1-2g剪碎放入研钵中加80%丙酮5ml、并加少许碳酸钙、研磨成匀浆，再加80%丙酮10ml，用漏斗过滤于试管中，残渣及滤纸用80%丙酮冲洗，一同过滤于试管中，即为叶绿体色素提取液，置暗处备用。 2.叶绿体色素的分离 ⑴.取层析纸条一张(2cm×20cm)，将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条。 ⑵.用毛细滴管吸取叶绿素溶液点于窄条的上方，一次最好点1滴，吹干 或风干后再点，这样重复点多次。 ⑶.取大试管(平底试管)一只，加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠，然后将滤纸条固定于橡皮塞上，插入大试管内，使窄条浸入溶剂中(色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁)，盖紧橡皮塞，直立于阴暗处进行层析(途中不能移动)。待展开剂前沿接近层析纸条上沿时，取出层析纸条，观察分离后色素带的分布。

  22. 3.叶绿体色素的理化性质的观察 ⑴.吸收光谱 将上述色素提取液用分光镜观察其吸收光谱。 ⑵.叶绿素的荧光现象 将上述色素提取液，分别在反射光和透射光下观察，在反射光 下观察到的血红色，即为叶绿素产生的荧光现象。 ⑶.去镁叶绿素的形成及铜离子的替代作用 取上述色素丙酮提取液少许(3-5ml)于试管中，一滴一滴加5% HCl，摇动，直至溶液变成褐色，此时叶绿素分子已遭破坏， 形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，于沸水浴中慢慢加 热，又产生鲜亮的绿色，即形成了铜代叶绿素。 三.实验作业 1.将层析纸上展开的色素斑点标上色素名称并附在实验报告上。 2.研磨叶片时为什么要加入少量的碳酸钙？

  23. 实验八 叶绿素a、b和胡萝卜素含量的测定 一、原理 叶绿素a、b及类胡萝卜素的丙酮提取液在可见光波长范围内的最大吸收峰分别位于663nm、645nm及440nm处，同时在该波长时chla、chlb及类胡萝卜素的比吸收系数是已知的，根据Lambert-Beer定律，可列出浓度(C)与光密度之间的关系式如下：

  24. D663=82.04Ca+9.27Cb..................…..⑴ D645=17.65Ca+45.6Cb.................…...⑵ ◆式中： D663、 D645为叶绿素溶液在663nm、645nm时的光密度。 Ca 、Cb为chla、chlb的浓度，浓度单位为g/L。 82.04、9.27为chla、chlb在波长663nm时的比吸收系数。 17.65、45.6为chla、chlb在波长645nm时的比吸收系数。 ◆解方程⑴、⑵得： CA=12.7A663-2.69A645...........................⑶ CB=22.9A645-4.68A633...........................⑷ CT=A+B=20.2A645+8.02A663...........….⑸ 浓度单位为每升毫克数(mg/L)。 ◆同样，胡萝卜素为： CK=4.7A440-0.27CA+B.........................…⑹ 浓度单位为每升毫克数(mg/L)。

  25. 二.操作步骤 1.色素的提取 取新鲜叶片，洗干净并搽干叶面的水分、去叶柄和中脉,称取 0.2-0.5g于研钵中加少量碳酸钙、80%丙酮2-3ml，研成匀浆，将匀浆用80%丙酮定容至10ml，摇匀后马上取上清液2.5ml于一试管中，再加80%丙酮10ml，摇匀，过滤(或离心),备用。 2. 测定吸光度 将色素提取液置光径1cm的比色杯内(如果色素提取液颜色深需稀释)以80%丙酮校零，在波长663nm、645nm和470nm下分别测定OD。 三.结果计算： 按公式⑶-⑹分别计算chla、chlb、总叶绿素及类胡萝卜素的浓 度。再根据稀释因子计算出各色素的含量(以mg/gFw表示)。 1.CA(mg/gFw)=(12.7A663-2.69A645 )×N 2.CB (mg/gFw)=(22.9A645-4.68A633 ) ×N 3. CT (mg/gFw)=(A+B=20.2A645+8.02A663 )×N 4 .CK (mg/gFw)=(4.7A440-0.27CA+B )×N 5.计算a/b=？

  26. 实验九 光合作用强度的测定 一.原理 光合作用强度的测定可以反映植物光能的利用、制造有机物质的能力和植物的生长状 况。在生产实践中，是选育优良品种，合理密植以及科学管理作物的理论根据之一。通常用单位时间、单位叶面积的CO2吸收量或O2的释放量或干物质的积累量(即光合速率)来表示光合强度。

  27. 二.实验步骤 1.选择测定样品 选定有代表性植株叶片（如叶片的部位、叶龄、受光条件等） 10-20张，用小纸牌编号。 2.叶片基部处理 为了不使选定叶片中光合作用产物往外运，而影响测定结果的准确性，用5%三氯乙酸点涂叶柄基部，阻止光合产物的输出。三氯乙酸是一种很强的蛋白质沉淀剂，渗入叶柄后可将筛管生活细胞杀死，而阻止光合产物的运输。三氯乙酸的浓度，视叶柄的幼嫩程度而异。以能明显灼伤叶柄，而又不影响水分供应，不改变叶片角度为宜。一般使用5%三氯乙酸。为了叶片不致下垂，可根据不同的植物，叶柄处理也可采用下列方法进行处理： （1）可将叶子输导系统的韧皮部破坏。如棉花等双子叶植物的叶 片，可用刀片将叶柄的外皮环割约0.5cm宽。 （2）如果是小麦、水稻等单子叶植物，由于韧皮部和木质部难以分开处理，可用刚在开水中浸过的纱布或棉花做成的夹子，将叶子基部烫伤一小段即可（一般用90℃以上的开水烫20s）用锡纸包裹叶柄。使叶片保持原来的着生角度。

  28. 3．剪取样品 叶柄基部处理完毕后，即可剪取样品，记录时间，按编号顺序（使各叶片照光时间尽量一致）分别剪下对称叶片的一半（主脉不剪下），并按编号顺序夹于湿润的纱布中，带回室内贮于暗处。光照5-6h后，再依次剪下另外一半叶片，同样按编号夹于湿润纱布中。 4．称重比较 将照光和和黑暗中的叶片分别重叠在一起，用相同孔经的打孔器分别取100片小圆片，分别置于两个已知重量的铝盒中，80~90℃下烘干至恒重（约4-5h），置干燥器平衡后于天平上称重比较。 三. 结果计算 以干物质计，mg/dm2·h表示。 计算公式如下： 光合作用强度= 由于叶内贮存的光合作用产物一般为蔗糖和淀粉等，可将干物质重量乘 以系数1.5，得CO2同化量，单位为mg/dm2·h。 （光下叶片干重– 暗下叶片干重）mg 叶面积（dm2) × t（h)

  29. 四.注意事项 1.叶柄的环割或处理是实验的关键。 2.称重前必须在干燥器中平衡，否则误差很大。

  30. 实验十 呼吸强度的测定 测定呼吸作用一般测定呼吸过程消耗的O2量或放出的CO2量。测定方法主要有：小篮子 法、红外线CO2分析仪法、测压法、气流法、呼吸比重计法、称重法和热量计法等。 一.原理 ◆植物组织的呼吸强度，可用单位重量(g)植物材料在单位时间(h)内释放的CO2量来表示。小蓝子法是采用滴定法测定呼吸强度。将被测定的材料装入一个尼龙网袋(小蓝子)内，悬挂在密封的广口瓶内。广口瓶中装有Ba(OH)2 ,用来吸收材料呼吸过程中释放的CO2，

  31. 呼吸强度的测定 然后用已知浓度的H2C2O4溶液滴定剩余的Ba(OH)2,从空白和样品两者消耗H2C2O4溶液体积之差，即可计算呼吸过程中释放CO2的量。有关反应如下： CO2+ H2O→H2CO3 Ba(OH)2+H2CO2→BaCO3+ 2H2O Ba(OH)2(剩余部分)+H2C2O4→BaC2O4+ 2H2O

  32. 呼吸强度的测定 一.实验装置 取500ml广口瓶一个，配置一个三孔橡皮塞，其中一孔插入装有碱石灰的干燥管，以吸收空气中的CO2，保证进入广口瓶的空气无CO2，一孔插入温度计，另一孔(直径约1cm左右)供插滴定管，未插滴定管前用小橡皮塞塞紧。瓶塞下面挂一尼龙网制小篮，供装实验材料。

  33. 二.操作步骤 1.称取刚开始萌发的水稻或小麦种子10-15g，装于小篮内，将小篮子固定 在橡皮塞上，同时向广口瓶中加0.05mol/L Ba(OH)2溶液20ml，立即塞 紧瓶塞。实验途中每5分钟左右轻轻地摇动广口瓶一次，破坏溶液表面的 BaCO3薄膜,以利对CO2的吸收。 2.另取用沸水煮死的种子为材料，按上述方法作同样测定，作为实验对照。 3.到30-60分钟时间后，小心打开瓶塞，迅速取出小篮子，加入1-2滴酚酞 指示剂，立即重新塞紧瓶塞。然后拔出插在滴定管孔口的小橡皮塞，将 滴定管插入孔中，用1/44mol/L的H2C2O4滴定，直到红色转变成无色为终 点(若30秒钟内溶液又变为红色，可补加1滴H2C2O4,记录滴定所耗用的 H2C2O4溶液的体积(ml数)。 三.结果 按每消耗1ml H2C2O4溶液相当于1mgCO2来计算种子在呼吸时所放出CO2 的mg数。 计算公式： 呼吸强度(CO2mg/gFw·h)= 式中: V0为煮死的种子所耗用H2C2O4的体积（ml） V1为发芽的种子所耗用H2C2O4的体积（ml） (V0 —V1) W(g)× t(h)

  34. 实验十一 过氧化物酶活性的测定 一.原理 过氧化物酶(POD)广泛存在植物体中、是呼吸作用过程中一个重要的末端氧化酶，与IAA的氧化(在细胞质中起IAA氧化酶的作用)，在植物生长发育的整个过程中，其活性不断发生变化，因此测定POD的活性，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 在H2O2存在下，POD催化将愈创木酚氧化成茶褐色的产物。生成物在470nm处有最大吸收，通过测定生成物的含量，可计算出POD活力或比活力。

  35. 二.操作步骤 1. 称取植物材料(土豆、小白菜等)0.5g，加5m1 0.1mol/Ltris-HCl缓冲液(PH8.5)，于研钵中研磨成匀浆，于4000rpm下离心15min，倾出上清 液，(必要时，残渣再用5ml缓冲液提取一次，合并两次上清液)，贮存于冷处(0~5℃)，备用。 2. 取光径1cm比色杯2只，于1只加入上述酶液1ml(如酶活性过高可稀释之，土豆约稀释10倍)，再加入反应混合液3ml，立即开启秒表记录时间，另取一只比色杯并加入0.2M磷酸缓冲液(PH6.0)作校零，于波长470nm测量吸光度，每隔1min读数一次，(一般测定反应0~3min或0~5min内的光密度值，取其平均值计算). 三 .结果计算 以每min内OD470变化0.01为一个酶活力单位(U)计算POD的活力或 比活力。 计算公式： POD活力(U/min)= ×N POD比活力(U/gFw·min)= ×N ΔOD470 0.01×t ΔOD470 0.01×W×t

  36. 实验十二 植物组织中还原性糖含量的测定 一.原理 糖在H2SO4作用下脱水，生成羟甲基呋喃醛，蒽酮在H2SO4作用下生成蒽酚，羟甲基呋喃醛在蒽酚作用下，发生缩合反应，形成绿色络合物，其颜色的深浅与糖含量呈正相关。由于蒽酮与糖反应的显色随时间变化，故必须在加入蒽酮后立即比色。该实验方法简便，其缺点是没有专一性，因为绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮发生反应，生成绿色络合物。

  37. 植物组织中还原性糖含量的测定 二. 操作步骤 1.糖绘制标准曲线 准确称取经80℃烘干的AR葡萄糖100mg，用蒸馏水定容至500ml，即每ml含糖为200mg的标准溶液。将其稀释成一系列0~200ug/ml的不同浓度的溶液，即糖浓度分别为0.00、0.25、 0.50、0.75、100、120、150、200ug/ml，用蒸馏水定容至100ml，取上述溶液1ml于试管中，加蒽酮试剂5ml，混匀后于沸水中加热10分钟，取出冷却，于波长625nm测定其OD值，然后绘制标准曲线(或求得直线回归方程)。

  38. 2.可溶性糖的提取 称取约0.2g的新鲜植物叶片于研钵中，加乙醚1ml，仔细研磨成匀浆，转入带塞试管中，用10-15ml蒸馏水洗涤研钵，洗液并入试管中。将试管置水浴锅中加热，保持70-80℃的温度约半小时，取出冷却后1滴1滴地加入饱和醋酸铅溶液，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此提取液(连同残渣)洗入50ml容量瓶 中，加蒸馏水定容，充分振荡。用漏斗将溶液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量(约0.2-0.4g)草酸钠，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再过滤一次，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。 3.糖浓度的测定 吸取上述过滤液1ml于试管中，加蒽酮试剂5ml，混匀后于沸水浴(90℃) 中加热10分钟，取出冷却，于波长625nm处比色。测得光密度，从标准曲 线上查得待测液得含糖量。另取一试管加1ml蒸馏水，加蒽酮试剂5ml， 后于沸水浴(90℃)加热10分钟，取出冷却，作校零对照。 三.结果计算 计算公式： 可溶性糖含量%= ×100% 式中：V---为植物样品提取得定容的体积(ml)，若含量高，需要稀释。 C---为提取液的含糖量(ug/ml)。 W---为植物组织鲜重(g)。 C×V W×106

  39. 实验十三 植物蛋白质含量的测定 一.原理 蛋白质在碱性条件下与硫酸铜生成紫色络合物，在一定范围内蛋白质含量与生成的络合物颜色呈比例关系，选用与生成物颜色相应的波长测定其OD，可计算出蛋白质的含量。 二.操作步骤 1.绘制标准曲线 称取经100目过筛的酪蛋白0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12g分别置于100ml干洁的三角瓶中，另取一个三角瓶，不加酪蛋白，各加碳酸铜1g、无水乙醇20ml，摇匀，勿使样品粘结于瓶底，再加10%KOH溶液20ml，继续摇动约30分钟，使之充分反应显色，将上清液过滤于一干洁的大试管中，立即在波长550nm处比色，读取光密度值，绘制标准曲线。

  40. 植物蛋白质含量的测定 2.样品的测定 将风干的米粒样品，磨粉，通过100目筛，称取 0.5-1.0g 放入干洁的三角瓶中，加碳酸铜1g、无水乙醇20ml，摇匀, 勿使样品粘结于瓶底，再加10%KOH溶液20ml，继续摇 动约30分钟，使之充分反应显色，将上清液过滤于一干洁 的大试管中，摇动、过滤，将过滤液于550nm处比色，从 标准曲线上查得样品的浓度。 三.结果计算 ◆计算公式： P (%) = ×100% ◆式中： P--为待测样品中蛋白质的含量(%)。 A--为从标准曲线上查得的蛋白质含量(%)。 B--为酪蛋白纯度(%)。 W--为样品重量(g)。 A×B W (g)

  41. 实验十四 吲哚乙酸含量的测定 一.原理 吲哚乙酸在无机酸存在的条件下，能与Fe作用生成红色的螯合物，其牙色的深浅与吲哚乙酸含量在一定范围内呈线性关系，选用与生成物颜色相应的波长测定其光密度，可计算待测液的吲哚乙酸含量。 二.操作步骤 1.绘制标准曲线 ⑴.IAA10mg，用少量无水乙醇溶解，再用蒸馏水定容至100ml，为 IAA母液。

  42. ⑵.IAA的系列标准溶液： IAA标准浓度(ug/ml)25 20 15 10 5 2.0. 1.0 IAA母液体积(ml) 2.5 2.0 1.5 1.0 0. 5 0. 25 0.1 用蒸馏水定容体积(ml)10 10 10 10 10 10 10 ⑶.取8只试管，每只分别加入不同浓度的IAA标准溶液2ml，再加入IAA试剂4ml，置于40℃的黑暗 （烘箱）处保温30分钟，使反应液呈红色，于波长530nm处测定光密度，记下OD并绘制标准曲线。

  43. 2.材料中IAA的提取 取玉米粉末10g于烧杯中，加入0.1N的NaOH溶液40ml，烧杯上面 加盖，以防止水分蒸发，置于100℃水浴中保温15分钟。从水浴中 取出后再加入0.1N的NaOH溶液25ml，充分摇匀，再用甲醇定容至100ml，静置30分钟。取上清液在4000rpm离心20分钟，上清液 即为IAA提取液。 3. IAA的测定 取试管一只，加入离心液2ml，再按制作标准曲线的步骤⑶测定待测液的光密度。 三.结果计算 计算公式： IAA含量(ppm)=E×S×N ◆式中： E--为待测液测得的光密度值。 S--为标准曲线系数。 N--为稀释倍数。

  44. 实验十三、十四 IAA含量及IAA氧化酶活性的测定 一.原理 植物体内IAA氧化酶活性的大小，对调节植物 体内IAA的水平，起着重要的作用，IAA在IAA氧化酶的作用下，失去活性，用有IAA氧化酶对IAA氧化和无IAA氧化酶的对照处理，通过测定二者IAA的含量，可知道在单位时间内，IAA被氧化的量。以其破坏IAA的速度表示IAA氧化酶活力的大小，而IAA含量可用比色法测定。 二.标准曲线的制作 1.IAA的系列标准溶液： IAA标准浓度(ug/ml) 25 20 15 10 5 2.0. 1.0 IAA母液体积(ml) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.25 0.1 用蒸馏水定容体积(ml) 10 10 10 10 10 10 10 2.取8只试管，每只试管ug/ml分别加入不同浓度的IAA标准溶液2ml，再加入试剂B4ml，置于40℃的黑暗（烘箱）处保温30分钟，使反应液呈红色，于波长530nm处测定光密度，记下OD并绘制标准曲线。

  45. 二.操作步骤 1. IAA氧化酶酶液的提取 取大豆或绿豆芽的下胚轴2-3g于研钵中，加入预冷的磷酸缓冲溶液(PH6.1) 5ml，于冰浴中研磨至匀浆，用磷酸缓冲溶液定溶至10ml，在4000rpm离心15分钟，上清液即为IAA氧化酶酶液。 2. 取一只试管，加入2ml酶液、MnCl2 1ml、2.4-二氯酚 1ml、磷酸缓冲液(PH6.1)4ml、IAA溶液2ml，为酶作用组。另取一只试管，除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余和第一只试管相同，为CK组，混合均匀后将两只试管迅速置30℃恒温水浴中，保温30分钟。 3.另取两支试试管，一只试管加入酶作用组液2ml，另一只试管加入对照液2ml，再各加入IAA显色试剂(试剂B)4ml，混合均匀，于40℃黑暗处(烘箱内)放置30分钟，使反应液呈红色。 4. 取红色液于波长530nm处比色，记下OD。（校零液： 2ml磷酸缓冲液，加试剂B 4ml）。 三.结果计算  以每克鲜重样品氧化IAA的量(ug)表示IAA氧化酶活力大小。 计算公式： IAA氧化酶活性ugIAA/gFw.h= ×N CK组IAA含量－酶作用组的IAA含量 w (gFw) ×t(h)

  46. 实验十六 赤霉素对a-淀粉酶的诱导形成 一.原理 大麦（或小麦）种子吸水开始萌动后，胚乳中的淀粉在a-淀粉酶的作用下，水解为糖，a-淀粉酶是在胚乳中释放的赤霉素的作用下，在糊粉层中合成或被激活 的。因此，没有胚存在或者说没有赤霉素的参与， a-淀粉酶就不能形成或被激活。 二.操作步骤 1.选用大小一致、具有生活力的大麦或小麦种子，用刀片将每粒种子横切成两半，使成为有胚的半粒和无胚的半粒，分别置于1%的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，取出用无菌水冲洗数次，备用。

  47. 2.取小瓶6只，编号，按下表加入各种溶液和材料 2.取小瓶6只，编号，按下表加入各种溶液和材料 编GA溶液浓度 ml数 含链霉素醋酸缓 实验材料 号 10 1 1 10个有胚半粒 2 0 1 1 10个无胚半粒 3 2×10-5 1 1 10个无胚半粒 4 2×10-6 1 1 10个无胚半粒 5 2×10-7 1 1 10个无胚半粒 62×10-8 1 1 10个无胚半粒 *使小瓶中混合液的最后浓度，赤霉素分别为2×10-5、2×10-6、 2×107、 2×10-8mol/L，醋酸缓溶液浓度为5×10-4mol/L，链霉素 含量为 0.5 mg/ml，将小瓶于25℃条件下培养24小时（进行振荡培 养或经常摇动小瓶）。 （mol/L） 缓冲溶液ml数

  48. 赤霉素对a-淀粉酶的诱导形成 3.淀粉酶活力分析 从每个小瓶中吸取培养液0.1 ml，分别置于事先盛有1.9ml淀粉磷酸盐溶液中，混匀，在30℃温箱活水浴中保温10分钟，再加I-KI溶液2ml，蒸馏水5ml，充分摇匀，于波长580nm处测定其OD，以蒸馏水作校零对照，所得OD从曲线上查得淀粉含量，以分解的淀粉量衡量淀粉酶活性的大小。

  49. 实验十五 种子生活力的快速测定 一.原理 凡具有生活力的种子胚，在呼吸作用过程中 都有氧化还原反应，而无生命活力的种子胚则无此反应。当TTC渗入种子胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2)上的氢还原时，使无色TTC变为红色的三苯基甲腙(TTF)图，使种子胚着红色。而种子胚生活力衰退或部分丧失生活力的种子浸透TTC 时，种子胚染色较浅或局部染色或完全不染色。因此可根据胚染色部位或染色的程度鉴定种子的生活力。 凡生活细胞的原生质膜具有选择透性，而死的种胚细胞原生质膜丧失这种能力，于是染料（红墨水）便能进入死细胞而胚被染色。

  50. TTC的还原反应: H N N—C6H5 N N—C6H5 C6H5-C Cl C6H5--C + HCl N=N—C6H5 N=N—C6H5 +2H TTC(无色) TTF(红色)

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