Valkude lahutamine kapillaarelektroforeesis

1. Valkude lahutamine kapillaarelektroforeesis

2. Probleemid valkudega • ”kleepuvad” pindadele ja interakteeruvad paljude teiste molekulidega • omadused (hüdrofoobsus, lahustuvus vees, laengute arv jne.) varieeruvad palju • “tõelistes” proovides esineb sageli väga lähedaste omadustega valke • Väga tundlikud keskkonnamuutustele (pH, temperatuur, lahuse koostis)

3. CE meetodid valkude analüüsil • CZE – kapillaartsoonelektroforees • MECC – mitsellaarne kapillaarelektrokromatograafia • CGE – kapillaargeelelektroforees • CIEF – kapillaarisoelektriline fokusseerimine

4. CIEF • Väga sarnane klassikalisele isoelektrilisele fokusseerimisele: • Tekitatakse pH gradient • Valgud lahutatakse nende isoelektriliste täppide erinevuste alusel • Peamine erinevus on selles, et lahutamine toimub kapillaaris

5. CGE eelised • Kapillaar täidetakse geeliga, valgud liiguvad läbi geeli pooride. • Väga sarnane klassikalisele geelforeesile. • Kleepumine kapillaari seintele ja difusioon on maha surutud. • Võimalikud väga suured efektiivsused. • Väga suur lahutusvõime.

6. CGE probleemid • kapillaarid on suhteliselt haprad • ei saa kasutada kõrgemaid pingeid ja kõrgemaid ioontugevusi • puhvri vahetamine on keeruline ja aeganõudev • kapillaarid on kallid, nende isevalmistamine ei anna alati väga stabiilseid tulemusi • proovi saab sisestada ainult elektrokineetiliselt

7. MECC • Kasutatakse klassikaliselt neutraalsete ühendite lahutamiseks • Sarnaneb CZE-le, aga taustelektrolüüdile lisatakse pindaktiivset ainet • Moodustuvad mitsellid • Pindaktiivsed ained võivad olla laetud negatiivselt, positiivselt või olla laenguta • Űhendid lahutuvad hüdrofoobsuste erinevuse alusel

8. MECC • Kerge kasutada • Lihtne muuta taustelektrolüüdi koostist • Vähendavad valkude kleepumist seinale • Ei kaota täielikult valkude interaktsiooni kapillaari seinaga • Interakteeruvad valkudega • Võivad lõhkuda kapillaari katet

9. MECC II • Katioonsed ja anioonsed pindaktiivsed ained (CTAB, SDS) interakteeruvad valkudega rohkem kui neutraalsed pindaktiivsed ained • Neutraalseid (zwitterioonseid) pindaktiivseid aineid (Brij, Tween) kasutatakse peamiselt adsorptsiooni vähendamiseks • Viimased ei lisa palju ioontugevusele

10. MECC III • Piimavalkude puhul on kasutatud SDS-i tema kriitilise kontsentratsiooni juures • Neutraalseid pindaktiivseid aineid (Tween 20, Brij 35 ja 78) on kasutatud - laktoalbumiini ja -laktoglobuliini lahutamiseks

11. CZE eelised • Lihtne • Taustelektrolüüdi muutmine ja vahetamine on kerge • Analüüsid sageli kiiremad kui MECC puhul • Kaetud kapillaarid säilivad (sageli) paremini

12. CZE probleemid • Valkude adsorptsioon kapillaari seinale võib hävitada kogu analüüsi või seada ohtu kvantitatiivse analüüsi • Eriti ilmneb adsorptsioon aluseliste valkude puhul (pI > 7) kui taustelektrolüüdi pH on üle 3

13. Võimalused adsorptsiooni vähendamiseks • kasutada ekstreemseid pH väärtusi • kasutada kapillaari seina modifitseerijaid, mis elimineeriksid või muudaksid kapillaari seina laengu.

14. Ekstreemsed pH väärtused • Eelised: lihtne, mugav ja odav • Puudused: • Valgu bioloogiline aktiivsus võib muutuda • Kõrgetel pH väärtustel võib kapillaari sein muutuda • Ekstreemsematel pH väärtustel on valkude liikuvused väga tundlikud • Võib toimuda valkude lahtikeerdumine või agregaatide tekkimine – paljude looduslike molekulkonformatsioonide uurimine on välistatud

15. Kapillaari seina modifitseerimine • Dünaamiline modifitseerimine • Permanentne modifitseerimine • Semi-permanentne modifitseerimine

16. Dünaamiline modifitseerimine • kapillaari pestakse modifikaatori lahusega, mis interakteerub kapillaari seinaga ja muudab selle laengut, aga ei ole seinaga kovalentselt seotud • modifitseerija on alati kasutatava taustelektrolüüdi koostises

17. Dünaamiline modifitseerimine Modifitseerijad I Kõrge soolasisaldusega või kõrge ioontugevusega puhvrid • 0.25 M K2SO4 – soolaioonid konkureerivad valgu molekulidega. Puuduseks UV neelduvuse vähenemine. • Kõrge ioontugevusega ( 0.5 M) fosfaatpuhvrid, mis on kasutatavad ka madala UV piirkonnas. Puuduseks on asjaolu, et kõrge ioontugevus põhjustab puhvri kuumenemist. • Tsvitterioonsete soolade (betaiin, triglütsiin) lisamine vähendab küll adsorptsiooni, aga ei mõjuta puhvri juhtivust • Kahevalentsed katioonsed amiinid (1,4-diaminobutaan; 1,5-diaminopentaan; morfoliin ). Sobib aluseliste valkude lahutamisel.

18. Dünaamiline modifitseerimine Modifitseerijad II • Mitteioonsed pindaktiivsed ained (Tween20, Brij35). Kasutatakse juhul kui kapillaari sein on kaetud hüdrofoobse ainega. • Anioonsed (SDS) ja katioonsed (CTAB) pindaktiivsed ained 1 g valku seondub 1.4g SDS-iga, moodustades SDS-valgu kompleksi. • Karbamiid on paljudel juhtumitel kasutatav kui valke denatureeriv ja väljasadenemist takistav reagent. Hoiab ära agregaatide tekkimise valgu molekulide vahel. Neelab madalatel lainepikkustel UV kiirgust.

19. Dünaamilise modifitseerimise plussid ja miinused • Eelised on lihtsus ja odavus. • Puuduseks on modifitseerija pidev kohalolek ja kapillaaris toimuvate protsesside mõjutamine.

20. Permanentsed modifitseerijad • Neutraalsed katted(polüakrüülamiid ja metüültselluloos) • Positiivsed katted(polüimiin)

21. Permanentsete modifikatsioonide plussid ja miinused • Adsorptsiooni mahasurumine efektiivne • EOF-i mahasurumine/modifitseerimine efektiivne • Modifitseerija ei mõjuta kapillaaris toimuvaid reaktsioone • Kaetud kapillaarid on kallid või töömahukad • pH tööpiirkond on piiratud • Pindaktiivsete ainete taluvus piiratud • Kaetud kapillaaride eluiga on piiratud

22. Semi-permanentsed modifitseerijad • On enamasti kahe alküülahelaga pindaktiivsed ained (didodetsüüldimetüülammoonium bromiid, fosfatidüülkoliin jne.) • Adsorbeeruvad kapillaari seinale hüdrofoobsed/elektrostaatilised interaktsioonid) • Modifitseerija ei ole taustelektrolüüdi koostises • Kapillaari katet on vaja aeg-ajalt uuendada

23. Semi-permanentsete modifitseerijate plussid ja miinused • Kapillaari modifitseerimine lihtsam ja odavam kui permanentsete katete korral • Kapillaari katte uuendamine triviaalne • Adsorptsiooni mahasurumine efektiivne • Modifitseerija ei ole taustelektrolüüdi koostises • Katsete reprodutseeritavus võib väheneda • Analüüsiaeg reeglina pikeneb

24. Piimas leiduvad valgud • Lehmapiim sisaldab 3-3.5 % valke • Neist u. 80 % on kaseiinid: -, - ja -kaseiinid (moodustavad mitselle, piima kolloidne osa) • Űlejäänud 20 % on nisuvalgud nagu -laktoglobuliin, -laktalbumiin, veise seerumi albumiin, immuunoglobuliinid jne.

25. Mõningaid näiteid valkude lahutamisest I Katmata kapillaarid • pH 7 – 9, 4M karbamiidi lahus (väldib kaseiinide agregeerumist). Saavutati peamiste piimavalkude lahutamine • Kõrge ioontugevuse ja pH juures (boraatpuhver, pH 10) saavutati kaseiinide osaline lahutamine. • 3 mM naatriumboraat, pH 9.5 ja SDS 8.2 mM – saavutati kiire lahutus (alla 2 min), aga valkude väljumise järjekord muutus

26. Mõningaid näiteid valkude lahutamisest II CGE põhimõte • Polüakrüülamiidiga täidetud kapillaar võimaldas nisuvalkude väga efektiivset lahutust 30 min jooksul • Aeganõudev kapillaari ettevalmistus, probleemid reprodutseeruvusega, kapillaari lühike eluiga, jne.

27. Mõningaid näiteid valkude lahutamisest III Dünaamiliselt modifitseeritud kapillaarid • Katmata kapillaar • 3 mM boraatpuhver, pH 9.5, 8.2 mM SDS (kriitiline kontsentratsioon vees) • Piimavalkude lahutamine 2 min jooksul • SDS interakteerub valkudega ja muudab nende omadusi • Lahutuse efektiivsus ja reprodutseeritavus jätavad soovida

28. Mõningaid näiteid valkude lahutamisest IV Katioonsed polümeersed modifitseerijad • Modifitseerija N,N-dimetüülakrüülamiid - etüülpürrolidiinmetakrülaat – DMA-EPyM – süntees • Modifitseerija puhastamine (kromatograafiline) ja polümeriseerimine • Lõpp-produkti puhastamine • Kapillaari voolutamine 2 min lahja polümeeri vesilahusega (0.1 mg/ml) enne iga katset • Modifikaatoriga voolutamisele järgneb alati taustelektrolüüdiga voolutamine • Viidi läbi piimavalkude efektiivne lahutamine (pH 8.5, boraatpuhver)

29. Mõningaid näiteid valkude lahutamisest V Permanantselt modifitseeritud kapillaarid • Hüdrofiilne kapillaari kate, pH 3 tsitraatpuhver, 6M karbamiidi, metüülhüdroksüetüül-tselluloos. Täielik kaseiinide ja nisuvalkude lahutamine, kõrge efektiivsus, hea reprodutseeritavus • Polüakrüülamiidkattega kapillaar, fosfaatpuhver, pH 3, karbamiid – valkude lahutamine värskes piimas

30. Mõningaid näiteid valkude lahutamisest VI Semi-permanentne modifitseerimine • Uus kapillaar töödeldakse NaOH-i ja H2O-ga • Sellele järgneb kapillaari voolutamine modifitseerijaga (N: 0.1 mM DDAB taustelektrolüüdis, 5 minutit) • Kapillaari voolutamine taustelektrolüüdiga (N: 25 mM fosfaatpuhver, pH 4, 1-2 minutit) • Järgneb valkude lahutamine • Katsete vahel voolutatakse kapillaari 2 min DDAB lahusega, millele järgneb 1 min taustelektrolüüdiga

31. Valkudega analüüsiga seonduvaid fakte • Piimavalgud ei lahustu vees ja kleepuvad igasugusele hüdrofoobsele pinnale • EOF olemasolu ei ole kriitiline kuna madalatel pH väärtustel on kõik valgud positiivselt laetud • Liiga kõrge pH vähendab nn. “detekteerimisakent” • Probleemi lahenduseks võib olla pikem kapillaar või madalam pinge

32. Praktilisi soovitusi I • Proovi ioontugevus voiks olla vähemalt 10 korda väiksem taustelektrolüüdi omast • Kui kapillaari kate talub fosfaatpuhvrit siis on see eelistatav näiteks tsitraatpuhvri ees (absorbeerib vähem valgust 214 nm juures)

33. Praktilisi soovitusi II • Kaetud kapillaaride korral võib piimaprodiktides leiduv rasv lõhkuda kapillaari katet – sel juhul võib olla abi kapillaari voolutamisest taustelektrolüüdiga katsete vahel (kuni 10 min) • Rikutud katet saab taastada voolutades kapillaari atsetonitriili:vee segudega (50:50 ja 100:0) – selle järel tuleb uuesti voolutada taustelektrolüüdiga

34. Lisainfot – tööstuslikult kaetud kapillaarid • PVA (polüvinüülalkohol-) kaetud kapillaar Agilendilt * • P1 kaetud kapillaar Supelcolt * • DB-WAX (polüetüleenglükool-) kaetud kapillaar J&W Scientific • DB-1 (dimetüülpolüsiloksaan-) kaetud kapillaar J&W Scientific* • Gaasikromatograafiakolonnid on märgatavalt odavamad • Stabiilsuse kohta KE tingimustes pole veel piisavalt andmeid

35. Katioonsete polümeeridega modifitseerimine • Kapillaare voolutatakse katioonse polümeeri (Polybrene, polüetüleenamiin) lahusega • Polümeer adsorbeerub tugevasti negatiivselt laetud kapillaari seinale (elektrostaatiline interaktsioon) • Jäägid pestakse kapillaarist välja ja analüüs võib alata

36. Katioonsete polümeeridega modifitseerimise plussid ja miinused • Lihtne ja suhteliselt odav • modifitseeritud kapillaaride uuesti modifitseerimine või “värskendamine” on lihtne • Modifitseerija ei ole taustelektrolüüdi koostises • Modifitseerimisprotseduur on sageli aeganõudev • Katsete reprodutseeritavus võib olla väike