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蔡国响 博士 复旦大学附属肿瘤医院 大肠外科 复旦大学大肠癌诊治中心

第六届中国肿瘤学术大会－上海 · 2010. 局部进展期散发性结直肠癌 CpG 岛甲基子表型 和预后的关系. 蔡国响 博士 复旦大学附属肿瘤医院 大肠外科 复旦大学大肠癌诊治中心. 1. 研究背景. 结直肠癌发病率居上海市区恶性肿瘤第二位。 30 － 40 ％结直肠癌患者最终死于复发转移。 TNM 分期是目前预测复发转移、指导辅助治疗的最佳依据。 美国 SEER 数据显示：部分 TNM 期别和预后之间缺乏相关性（ Ⅲ A 期结直肠癌生存率反而高于 Ⅱ B 期）。

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蔡国响 博士 复旦大学附属肿瘤医院 大肠外科 复旦大学大肠癌诊治中心

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  1. 第六届中国肿瘤学术大会－上海·2010 局部进展期散发性结直肠癌CpG岛甲基子表型 和预后的关系 蔡国响 博士 复旦大学附属肿瘤医院 大肠外科 复旦大学大肠癌诊治中心 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 1

  2. 研究背景 • 结直肠癌发病率居上海市区恶性肿瘤第二位。 • 30－40％结直肠癌患者最终死于复发转移。 • TNM分期是目前预测复发转移、指导辅助治疗的最佳依据。 • 美国SEER数据显示：部分TNM期别和预后之间缺乏相关性（ ⅢA期结直肠癌生存率反而高于ⅡB期）。 • 在TNM分期基础上，发现和应用新的分子生物学指标提高预后判断准确性是目前肿瘤研究热点。然而，迄今尚未找到公认的具有临床应用价值的预后分子指标。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 2

  3. 研究背景 非DNA序列变化引起的 可遗传的基因表达改变 全基因组低甲基化 表遗传学 癌基因异常甲基化 遗传学 抑癌基因过度甲基化 组蛋白异常修饰 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 3

  4. 研究背景 抑癌基因启动子甲基化导致基因失表达 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 4

  5. 研究背景 正常大肠粘膜 基因启动子CpG岛非甲基化 大肠癌组织 基因启动子CpG岛甲基化 大肠癌相关肿瘤特异性甲基化位点：p14 、hMLH1、p16、MGMT、MINT1 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 5

  6. 研究背景 • CpG岛甲基子表型（CIMP）被认为是继染色体不稳定（CIN）和微卫星不稳定（MSI）之后发现的第三种基因组不稳定机制。 • CIMP反映多个抑癌基因的同时过度甲基化状态。 • CIMP（＋）判断标准：同时甲基化位点的数目达到2/3、3/5、3/6或3/7等及其以上 。 • 结直肠癌CIMP的预后意义相关研究较少，存在一定的争议。 • 文献中未见同时研究三种基因组不稳定机制（CIMP、CIN和MSI）的预后价值的研究。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 6

  7. 研究目标 • 探讨各种临床病理以及分子生物学指标和Ⅱ/Ⅲ期散发性结直肠癌预后的关系。 • 探讨结直肠癌多基因甲基化的预后意义。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 7

  8. 研究对象 • 2004年7月－11月接受根治性手术切除的50例Ⅱ/Ⅲ期散发性大肠癌患者的原发病灶 • 初治患者 • 明确的术后病理诊断 • 术前未行放化疗 • 无任何肿瘤家族史 • 术后半小时内新鲜取材 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 8

  9. 研究方法－免疫组化检测（IHC） • 检测指标：k-ras、APC、p53、BAX、TGFβRⅡ • IHC结果的判断标准 • 肿瘤细胞胞浆（k-ras、APC、Bax、TGFβRⅡ）或胞核（p53 ）染色阳性者所占比例≥10％为阳性 腺癌，癌组织APC阳性表达，定位于细胞浆 9 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响

  10. 研究方法－流式细胞仪检测（FCM） • 倍体分析的判断标准 • DNA指数（DI）＝肿瘤细胞的G0/1峰均道值 /正常细胞的G0/1峰均道值 • 二倍体（DI＝1）和异倍体（DI≠1） • 异倍体者定义为CIN（＋） 二倍体 异倍体 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 10

  11. 研究方法－ 微卫星不稳定（MSI）检测 • 检测位点：BAT25、BAT26 • MSI的判断标准 • 微卫星位点阴性：主峰（单一峰型） • 微卫星位点阳性：主峰＋新生峰 • MSI（＋）： 2个位点中任意一个出现阳性结果 MSI（＋） MSI（－） 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 11

  12. 研究方法－甲基化特异性PCR（MSP） • 检测位点： p14 、hMLH1、p16、MGMT和MINT1 • MSP反应结果的判断标准 • 未甲基化：PCR产物电泳时只出现未甲基化条带 • 甲基化： PCR产物电泳时出现甲基化条带，无论是否出现未甲基化条带 • CIMP（＋） ：≥3/5个位点同时出现甲基化条带 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 12

  13. 统计学分析 • SPSS11.5软件 • 生存分析： • 寿命表法：计算无疾病生存（DFS） • 单因素分析：Kaplan-Meier法 • 多因素分析：Cox回归法 • 检验标准：P <0.05 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 13

  14. 研究结果－临床病理信息 • 性别：男性23例，女性27例。 • 年龄：平均54.54 ± 11.76岁（22-80岁）。 • 部位：结肠癌18例，直肠癌32例。 • 肿瘤最大径：平均5.24 ± 2.53 cm（2-16cm）。 • 组织类型：腺癌39例，粘液腺癌11例。 • 分化程度：高中分化36例，低分化14例。 • 脉管或神经侵犯：脉管侵犯（+）6例，神经侵犯（+）4例。 • TNM分期：ⅡA期11例， ⅡB期7例，Ⅲ期32例。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 14

  15. 研究结果－随访情况 • 辅助化疗：36例患者接受含5Fu方案的静脉化疗3月以上 • 随访时间：全部病例随访超过3年，平均随访时间47.64 ±17.68月。 • 生存情况：死亡13例。5年总生存率62％。 • 复发转移：局部复发3例，远处转移19例，复发或转移20例（其中2例为远处转移同时合并局部复发）。5年无疾病生存率（DFS）58％。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 15

  16. 研究结果－分子生物学检测 • 肿瘤抗原检测： • CEA异常升高者9例（＞10ug/l），CA19.9异常升高者10例（＞37 U/ml） • IHC检测： • 蛋白表达阳性者：k-ras（21例）、APC（20例）、p53（21例）、BAX（34例）、TGFβRⅡ（29例） • 倍体分析： • 二倍体16例，异倍体33例，1例因CV值大于8％从分析中剔除。 • MSI检测： MSI（＋）者6例（12％） • MSP检测： • 单一基因高甲基化者：hMLH1（7例）,MGMT（14例）,p16（13例）,p14（15例）,MINT1（27例）。 • CIMP（＋）者12例（24％）。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 16

  17. 研究结果－DFS生存分析（临床病理指标） 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 17

  18. 研究结果－ DFS生存分析（分子生物学指标） 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 18

  19. 研究结果－ DFS生存分析（分子生物学指标） 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 19

  20. 研究结果－ DFS生存分析（CIMP） Ⅱ/Ⅲ期散发性结直肠癌无疾病生存分析（Kaplan-Meier法） 5y-DFS 66％ 5y-DFS 30％ 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 20

  21. 讨论－CIMP和结直肠癌预后的关系 • 文献中关于CIMP和结直肠癌预后的关系存在一定的争议。 • 多数研究显示CIMP阳性提示预后不良，和本研究结果一致。 • J Clin Oncol（2003） 21:3729–3736 • Clin Cancer Res（2007） 13:6093–6098 • Cancer Res（2008） 68:8541-8546 • 少数研究显示CIMP阳性者预后较好。 • Gut （2009）58:90–96 • 个别研究认为CIMP没有预后价值。 • Virchows Arch (2009) 455:485–494 • 研究结果存在差异的可能原因： • 甲基化基因panel不同。 • CIMP判断标准不同。 • 实验方法不同：MSP、MethyLight、Pyrosequencing 。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 21

  22. 讨论-单基因高甲基化和结直肠癌预后的关系 • 本研究显示在CIMP的5个panel基因中，p16基因的高甲基化可能在结直肠癌的复发转移机制中扮演重要角色。 • p16是重要的细胞周期调控基因，其编码产物可与Cyclin D竞争结合CDK4/6，抑制Rb蛋白的磷酸化过程，从而抑制细胞的分裂增殖。 • p16基因启动子CpG岛高甲基化可以导致基因失表达，从而失去对CDK4/6的抑制作用，导致细胞恶性增殖。 • 文献几乎一致显示p16基因的高甲基化提示预后不良，和本研究结果一致。 • Clin Cancer Res（2007）13：6093-6098 • J Cancer Res Clin Oncol（2010）136：323-331 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 22

  23. 讨论- MSI和结直肠癌预后的关系 • 多数研究显示MSI是散发性大肠癌的重要预后因素。 • 本研究未能证实MSI的预后价值，可能和样本量小，MSI阳性病例少（仅6例）有关。 • CIMP可能是比MSI更有价值的预后指标。 • 局部进展期结直肠癌的复发转移率40％左右。 • 散发性大肠癌MSI阳性率10-15％。 • CIMP的阳性率20-40％。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 23

  24. 讨论-研究不足和展望 • 研究不足：样本量较小。 • 研究展望：寻找和结直肠癌复发转移密切相关的甲基化基因，建立预后相关的CIMP的甲基化基因panel ，进一步提高CIMP预后评估的准确性。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 24

  25. 结论 • CIMP是局部进展期散发性结直肠癌的独立预后不良因素。 • P16基因高甲基化可能在结直肠癌复发转移机制中扮演重要角色。 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 25

  26. 谢 谢 ！ 第六届中国肿瘤学术大会 －蔡国响 26

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