Лекция 5. ЭКСПРЕССИЯ ОРГАНЕЛЬНЫХ ГЕНОМОВ

1. Лекция 5. ЭКСПРЕССИЯ ОРГАНЕЛЬНЫХ ГЕНОМОВ Генные кластеры Хлоропластные промоторы Митохондриальные промоторы Гены РНК-полимеразы Процессинг матричных РНК Трансляция органельных матриц

2. Хлоропластные гены у высших растений собраны в полицистронные транскрипционные единицы – кластеры rpl23-rpl2-rps19-rpl22-rps3- rpl16- rpl14-rps8- infA- rpl36-rps11-rpoA 16S rDNA-trnI-trnA-23S rDNA-4.5S rDNA-5S rDNA L23 psbK-psbI-psbD**-psbC**-orf62-trnG psbE-psbF-psbL-psbJ Примеры кластеров пластидных генов с гомологичной функцией ndhC- ndhK- ndhJ atpB-atpE

3. Примеры генных кластеров пластидного генома с гетерологичными функциями orf31-petG-psaJ-rpl33-rps18 psbB-psbH-petB-petD rps2-atpI-atpH**-atpF-atpA По моноцистронному типу транскрибируются rbcL, psbA,ndhF,psbM, psbN, часть генов тРНК и некоторые другие

4. Митохондриальные гены растений транскрибируются как индивидуально, так и в составе полицистронных кластеров У секвенированных мтДНК высших растений 40 из 60 генов находятся в составе небольших кластеров ( по 2-3 гена), остальные транскрибируются моноцистронно Митохондриальные гены грибов и животных транскрибируются полицистронно

5. РНК-полимераза 5’ UTR ori 3’ UTR иРНК промоторcвязывается с РНК-полимеразой, что определяет точное место начала транскрипции Общая схема компонентов транскрипции

6. У прокариот промоторы: - 10 и –35 от начала гена Хлоропластные промоторные области разных генов: ГорчицаpbsA TTGGTTGACATGGCTATATAAGTCATGTATACTGTTCAAT ШпинатpbsA TTGGTTGACACGGGCATATAAGGCATGTATACTGTTGAAT “ rbcLTGGGTTGCGCCATATATATGAAAGAGTATACAATAATGATG “ atpBTCTTGACAGTGGTATATGTTGTATATGTATATCCTAGATGT “ trnM TTATATTGCTTATATATAATATTTGATTTATAATCAATCTA БактериальныеTTGACATATAAT промоторы сtp1 сtp2 Аналог промотора-35 Аналог промотора-10 Промоторы многих пластидных генов:РЕР являютсяаналогамии промоторов прокариот

7. А как в митохондриях? Митохондриальные тРНК гены растений Митохондриальные тРНК геныхлоропластного происхождения - + Мотив «–10–35» В митохондриальных тРНК генах пластидного происхождения имеется аналог прокариотического промотора

8. РЕР – промоторы взаимодействуют с plastid-encoded polymerase Такие промоторы есть не у всех хлоропластных генов Некоторые гены промоторные области содержат прямо в кодирующей части гена тРНК и 5S РНК Другие пластидные тРНК гены транскрибируются с помощью комбинации внешнего(upstream) и внутреннего промотора

9. Гены psbA и некоторые другие пластидные фотосинтетические гены высших растений между прокариотическими промоторами содержат мотив типа хорошо известного ТАТА бокса ядерных генов Это так наз. NEP-промоторы ( nuclear-encoded polymerase) pbsA TTGGTTGACATGGCTATATAAGTCATGTATACTGTTCAAT Промоторов у одного кластера генов в пластидном геноме может быть несколько – «множественные промоторы» Транскрипция atpB-atpE может инициироваться с четырех различных промоторных участков, самый проксимальный из которых даже перекрывается с кодирующей областью

10. Промоторы некоторых геновхлоропластов шпината и хламидомонас находятся внутри кодирующей области этих генов trnR1, trnS1 и некоторые другие Как это выяснили? Эффективная транскрипция этих генов с помощью растворимой РНК-полимеразы in vitroпроисходит, даже если участок перед кодирующей областью имеет протяженность менее 10 пар оснований. Однако транскрипция отсутствуету делеционных мутантов с утраченной частью trn-гена

11. Транскрипция с помощью комбинации предлежащего (upstream) и внутреннего промоторов Ген trnI Промоторная область, подобная ctp1-, ctp2, расположена на расстоянии 39 п.о. от начала гена Если она утрачивается, ген транскрибируется в пять раз менее интенсивно. Вероятно, существует второй, альтернативный промотор внутри самого гена, который может, хотя и менее успешно, заменить утраченный

12. В чем смысл существования множественных сайтов инициации транскрипции??? pr1pr2pr3 pr4 ген Х Наличие у одного гена нескольких промоторов обеспечивает тонкую регуляцию хлоропластной транскрипции с использованием двух рНК-полимераз и двух типов промоторов различной силы

13. Ряд пластидных генов имеют так называемые светочувствительные промоторы, их структура весьмаспецифична Наконец, некоторые гены содержат промоторы, обеспечивающие конститутивный синтез мРНК

14. Митохондриальные промоторы растений Состоят обычно из 17-18 нуклеотидов (-14+4), имеют центральный домен - 7+5 и вышележащий домен (-11-12) Угенаcox2 и других митохондриальных генов – множественные промоторы – от 2 до 6 Два промотора выявлено у митохондриального cob гена кукурузы, три – у cox3 и у atp9 гороха, четыре – у atp1 гороха

15. Структура промоторов у однодольных и двудольных растений различается Уоднодольных (кукуруза) замены нуклеотидов внутри промоторной области снижают инициацию транскрипции не очень значительно - на 10-40% Напротив, у двудольных замена G в положении +1 на Aприводит к потере 70% активности промотора дикого типа

16. Как именно транскрипционный аппаратидентифицирует промоторную последовательность ??? Гипотеза: молекула иРНК сканируется специфическими белками с 5‘ к 3‘ концу 5’ 3’ Pr1 Pr2 Равная эффективность инициации транскрипциис тандемно расположенных промоторов Значит, гипотеза сканирования молекулыневерна

17. Структура промотора в митохондриях двудольных растений и компоненты аппарата транскрипции IVD 43 kDa R-Pol 110 kDa TF 63 kDa TF 32 kDa NNNNNATAATAGCATAAGAGAAGNNNNN -14 -12-11 -8 -7 +1+2 +4 AT-боксПурин Высококонсервативный 10-нуклеотидный мотив

18. Важна не только первичная структура самого промотора, но и геномный контекст, в котором он расположен ! Выбор промотора может находиться под контролем ядерного генома Ядерный генMct (Modifier of cox transcript) влияетна выбор промотора при транскрипции сох2 гена у кукурузы У мутанта по Mctсниженокол-во копий типичноготранскрипта 1,9 т.п.н., но доминируетнетипичныйтранскрипт 1,5 т.п.н.,полученный с нетипичного промотора

19. У дрожжей промоторы митохондрийочень консервативны rnl ori4 ori3 Все промоторымитохондриального генома дрожжей начинаются с высококонсервативной последовательности 5'АТАТААGTA3' var 1 cox2 atp9 tmtl ori6 cox3 cob ori5 tsI ori2 ori7 ori1 atp8 rns atp6 ori8 Промоторы множественные cox1 Сильные и слабые промоторы

20. ATPase 9 тРНКSer Var1 Сильные и слабые промоторы дрожжей Ор1 Ор2 Какова причина? Промотор Ор1 в 12-15 раз сильнее, чем Ор2 (расстояние между ними 78 п.н.) Чем больше расстояние между сильным и слабым промоторами, тем слабее эффект подавления сильным слабого (>600 п.н. –эффектисчезает) При делеционном мутагенезе удаление сильного промотора в несколько раз повышает интенсивность транскрипции со слабого Чем ближе ген в ДНК-матрице к промотору, с которого идет полицистронная транскрипция, тем больше мРНК копий этого гена в митохондрии

21. HSP 9-нуклеотидный промотор Структура промоторов различается у различных классов позвоночных Ключевая последовательность - окружает сайт инициации транскрипции и совершенно необходима для транскрипции связываются с фактором инициации транскрипции, mtTFA Ключевая последовательность - предшествуетсайту инициации транскрипции и обеспечивает высокий уровень транскрипции LSP Человек (D-петля) Xenopus (D-петля) Gallus (D-петля) Дрожжи У земноводных оба промотора инициируют транскрипцию в обоих направлениях Уптиц один промотор инициирует транскрипцию в двух направлениях с обеих цепочек Митохондриальный геном животных транскрибируется полицистронно

22. L(CUN) S (AGY) H HSP2 HSP1 12S rRNA F D-loop V 16S rRNA ND 4 T L(UUR) CYTb LSP P OH I M E ND6 Q 1/16569 12427 4142 A N C Y 8285 S(UCN) COI D COII K R ND4L ATP6 COIII ND3 ATP8 На карте мтДНК млекопитающих выявлено два промотора, по одному для каждой цепочки: LSP и HSP Полицистронная м-РНК с LSPсодержит транскрипт8 генов, с HSP– всех остальных(29).LSP также участвует в инициации репликации мтДНК. Оба промотора инициируют транскрипцию только в одном направлении Предполагают также наличие на Н-цепи второго промотора, так как еще 25 лет назад было показано , что с Н-цепи существуют 2 полицистронных транскрипта: короткий (12S+16S рРНК) и длинный, несущий все гены Н-цепи. Количество первых в 50-100 раз превышает число транскриптов других генов ND1 ND 5 ND2 W OL G

23. Вотличие от хлоропластов, прокариотическое происхождение митохондриальных промоторов не является очевидным Скорее всего, промоторы митохондрий были эволюционно адаптированы к другому, чем у хлоропластов, типу РНК-полимеразы

24. РНК-полимераза органелл (ДНК-зависимая РНК полимераза) РНК-полимераза пластид РНК-полимераза E. сoli хлоропласт N и С-части β'-субъединицыкодируются разнымигенами 5 субъединиц а2ββ'β'' 4 субъединицы а2ββ' rpoA rpoBrpoC1 rpoC2 rpoA rpoBrpoC Гены rpo E.coli гибридизуются с ДНК пластид, что помогло обнаружить и локализовать rpoгены в хпДНК

25. Гены rpoA-rpoC гены обнаружены во всех секвенированных геномах пластид С помощью rpo- полимеразы транскрибируются в основном гены тРНК и белковхлоропластов А как транскрибируются сами rpoA-rpoC гены ???? Как ???

26. Существует в клетке еще одна РНК-полимераза пластид: РНК-полимераза пластидядерного кодирования • Ряд фактов свидетельствовал в пользу ее существования: • гены без РЕР-промоторов, • мутанты без пластидных рибосом, но интенсивно транскрибирующие • ряд пластидных генов, • нефотосинтетические растения-паразиты, не имеющие пластидных rpoгенов • делеционные мутанты по rpo, растущие в культуре клеток. В изолированных хлоропластах выявлены 2 фракции с РНК-полимеразной активностью, одна из которых чувствительна к рифампицину – ингибитору прокариотической РНК-полимеразы, вторая – резистентна Это полипептид 110kd, сходный с ДНК-полімеразой фага Т7. Активность фермента максимальна на разных стадиях развития пластид

27. РНК-полимераза пластид ядерного кодирования обеспечивает транскрипцию генов rpo(РНК-полимеразы ) в хлоропластах ядро цитоплазма пропластида транскрипция некоторых пластидных генов, в т.ч. РНК-полимеразы ген пластидной РНК-полимеразы белок 110кДа мРНК хлоропласт РНК-полимераза пластома транскрибирует остальные хлоропластные гены, в т.ч. гены фотосинтетических белков РНК-полимераза ядерного кодирования

28. Где расположены гены РНК-полимеразы митохондрий ? В секвенированных геномах митохондрий высших растений данный ген не был выявлен Митохондриально кодируемые РНК- полимеразы обнаружены лишь у простейшего и у бурой водоросли Reclinomonas Pylaiella аmericanalittoralis В ядре почти одновременно у пшеницы, табака, кукурузы нашли гены Т3- и Т7- фагоподобной РНК-полимеразы

29. В ядре арабидопсиса нашли семейство из трех родственных генов 2 гена - мт РНК-полимераза 1 ген - хп РНК-полимераза + Пшеница + Ген rpoTm Ген rpoTр кодирует мт РНК-полимеразу массой 113 кд кодирует хп РНК-полимеразу массой 107 кд Продукты геновrpoTmиrpoTр гомологичны по аминокислотному составу на 45%

30. Фаги Митохондрии дрожжей Митохондрии растений Хлоропласты растений Найдено 11 высококонсервативных доменов Гомология РНК-полимераз фагов и разных органелл грибов и растений: Гомология наиболее велика в каталитической части, наименьшая в промоторной

31. Митохондриальная РНК-полимераза дрожжей ядерный ген RPO41– кодирует белок размером 145 кд, значительная часть молекулы гомологична Т3 и Т7 фаговым РНК-полимеразам. Митохондриальная РНК-полимераза животныхтакже гомологична Т3 и Т7 фаговым РНК-полимеразам. C N последовательность, обеспечивающая импорт в митохондрии амино-концевое расширение область гомологии с бактериофаговой РНК-полимеразой Митохондриальная РНК-полимераза дрожжей кодируется ядерным геном RPO41

32. Структура комплекса T7 РНК-полимераза-промотер Аминокислотный консерватизм фагоподобной РНК-полимеразы органелл

33. (a) Rpo A,B,C,D rpoA,B,C1,C2 RpoY RpoZ Модельзамены в процессе эволюции органельной РНК-полимеразыбактериального типа на фагоподобные ферменты ядерного кодирования (b) (c) Утрата rpoA,B,C,D RpoY RpoY rpoA,B,C,D РНК-полимераза фагового типа (f) (e) (d) RpoY дупликация гена rpoA,B,C1,C2 RpoY RpoZ Утрата rpoA,B,C1,C2 RpoY (а) Reclinomonas americana, хотя отсутствие ядерногоRpoY гена еще не доказано;(b) пока не найден; (c) большинство эукариот; (d) возможно, некоторые водоросли (пока не изученные); (e) однодольные и двудольные растения; (f) паразитическое растение Epifagus virginiana.

34. Процессинг полицистронных матриц Полицистронные матрицы превращаются в моно- и дицистронные До тех пор, пока матрицы не стали моноцистронными, они не связываются с рибосомами. После разрезания каждая из мРНК транслируется независимо от другой.

35. Стабильность мРНК молекул у прокариот обеспечивается связыванием с рибосомами, у эукариотических генов ядра – кэпированием и полиаденилированием. А как обеспечивается стабильность матриц органельных мРНК? У большинства молекул пластидных мРНК содержит в нетранслируемой области на 3' конце последовательность с инвертированным повтором, которая складывается в стабильную петлю. Эти последовательности консервативны у одних и тех же генов даже у эволюционно отдаленных видов, но для разных генов в одном пластоме – разные. На хламидомонас показано, что полная или частичная делеция такого инвертированного повтора приводит к 60-80% потере мРНК данного гена, хотя кодирующая и 5'-UTR не изменены.

36. Первичный транскрипт Модель процессинга 3’области и деградации пластидной РНК Кодирующая область 5’ 3’ Эндонуклеазное разрезание Разрушение мРНК инициируется альтернативными механизмами: (1)эндонуклеазным расщеплением перед петлеобразной структурой с последующим 3’-полиаденили-рованием, которое в свою очередь, вызывает деградацию путем экзонуклеазной активности 3’ → 5’; или (2)полиаденилированием за петлеобразной структурой и последующей экзонуклеазной деградацией Экзонуклеазное укорачивание Стабильная РНК (связанная с белками) Эндонуклеазное разрезание Полиаденилирование АААААААА Полиаденилирование Экзонуклеазная деградация АААААААА Экзонуклеазная деградация АААААААА АААААААА (2) (1) У пластидных мРНК полиаденилирование – сигнал к деградации

37. Короткие инвертированные повторы на 3‘ конце транскриптов обнаружены также у ряда митохондриальных генов. Молекулы мРНК, содержащие такие транскрипты, отличаются более продолжительным периодом полу-жизни, чем не имеющие их. Вспомните, что длинные поли-А концы в транскриптах ядерныхгенов – гарант их стабильности. Деградация начинается с деаденилирования и де-кэпирования. У прокариотполиаденилирование провоцирует деградацию матриц. Полиаденилированиехлоропластных генов,как и у прокариот, провоцирует деградацию матриц Поли-А хвост хлоропластных генов может достигать длины нескольких сот нуклеотидов, в нем имеются вкрапления G и крайне редко – С или U. Очевидно, добавление поли-А делает мРНКуязвимой по отношению к нуклеолитической активности 3'-5'.Поли-А хвост обладает сродством к хлоропластнойэкзонуклеазе. Показано, что полиаденилирование фотосинтетических генных транскриптов усиливается в темноте

38. ACGCGGGC GAGTGGGT Модель вторичной структуры 3’инвертированных повторов митохондриальных генов растений (atp9 гороха) Защищают инвертированный повтор и вышележащие участки матрицы A-T A-T G-C A-T A-T A-T G-C G C-G C-G C-G C-G C-G A-T Кофакторы, вспомогательные белки ACTTTCGTTTT(N)n РНКаза GAGG (N)GGAC GAGG Последовательность, предшествующая первому двуспиральному участку (обнаружена у нескольких разных генов) G A C A

39. Недавно поли-А последовательности длиной 52-56 нуклеотидов обнаружены в митохондриальных транскриптах растений. В данном случае это также сигнал к деградации. Транскрипция – созревание (процессинг) транскриптов–сплайсинг (эдитинг)-трансляция В регуляции экспрессии как пластидных, так и митохондриальных генов основным этапом является не транскрипция, а трансляция

40. Инициация трансляции у прокариот: – комплекс Shine-Dalgarno (SD) инициирует образование комплекса между мРНК и 16S рРНК рибосом. SD – последовательность находится на расстоянии -7 ­ + 2 от AUG инициирующего кодона. Более половины хлоропластныхгенов также содержат (SD) последовательности, хотя расстояние до инициирующего кодона у растений более вариабельно: от 2 до 29 с пиком от 7 до 9. (SD)- последовательность в пластидах обычно GGAGG, хотя встречаются укороченные варианты: GGA, AGG, GAGG, GGAG.

41. 30S 30S 30S SD 50S 30S 30S 30S Четыре модели инициации трансляции в хлоропластах а) 30S SD AUG мРНК SD AUG 50S 70S инициирующий комплекс (б) 50S 30S 30S SD AUG мРНК AUG AUG SD SD 50S 70S инициирующий комплекс (в) 50S 30S 30S AUG AUG мРНК AUG 50S 70S инициирующий комплекс (г) 50S AUG SD AUG AUG мРНК 50S 70S инициирующий комплекс

42. Четыре модели инициации трансляции в хлоропластах (а) Элемент Shine-Dalgarno (SD) находится рядом с инициирующим кодоном (AUG). Связывание с 30S субъединицей рибосомы предшествует присоединению 50S субъединицы. Аналог классического бактериального механизма трансляции (пример - трансляция rbcL у ячменя). (б) SD последовательность удалена от инициирующего кодона. После присоединения 30S субъединицы к SD следует “сканирование” до встречи с инициирующим кодоном (пример - трансляция psbA у ячменя). (в) Инициация, не зависящая от SD последовательности. Для инициации требуется участие активатора трансляции (овал), который связывается с 5’UTR и 30S субъединицей (пример - трансляция psbС у Chlamydomonas). (г) Инициация, требующая как SD последовательности, так и активатора трансляции. Вторичная структура, образующаяся в 5’UTR и содержащая элемент SD, препятствует связыванию мРНК с 30S субъединицей рибосомы. Активатор трансляции (шестиугольник) разрушает вторичную структуру, 30S субъединица связывается с SD последовательностью, образуя 70 S инициирующий комплекс (пример - трансляция psbA у Chlamydomonas) При отсутствии структур SD связывание мРНК с рибосомой происходит за счет других механизмов. Например, взаимодействие 5' UTR мРНК с ядерно - кодируемыми факторами, которые могут быть как сайт-специфичны, так и активировать трансляцию многих мРНК. Хлоропластно кодируемые факторы инициации трансляции обнаружены в хлоропластном геноме эвглены и высших растений

43. ATP ATP PSII ADP+Pi ADP+Pi S–S HS SH S–S P NADPH киназа P D1 SH SH S S GUA AUG ? хлоропласт ? PABP цитоплазма PDI Модель активации трансляции psbA мРНК Chlamydomonas под действием света. Активаторы трансляции, кодируемые ядерным геномом, транслируются в цитоплазме и импортируются в хлоропласт. Уровень фотосинтетической активности хлоропласта связан с сPDI, переносчиком хлоропластного редокс-потенциала. Активность сPDI может ингибироваться ADP-зависимой киназой, когда фотосинтез, а значит и отношение АТP/ADP малы. Два не изученных пока активатора трансляции представляют собой белки 55 и 38 kDa

44. Таким образом, первоначально предполагавшаяся гомология экспрессии пластидных геномов с системой прокариотов оказалась весьма ограниченной МНОЖЕСТВЕННЫЕ ПРОМОТОРЫ, РАЗНЫЕ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, СЛОЖНЫЙ ПРОЦЕСС СОЗРЕВАНИЯ МАТРИЦ И ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ: система регуляции пластидных генов значительно сложнее, чем казалось вначале

45. Экспрессия генов в митохондриях растениях • необычна прежде всего образованием множественных транскриптов с одного участка генома. • Такая вариабельность размеров мРНК вызывается: • множественностью сайтов инициации транскрипции • множественностью сайтов терминации транскрипции • наличием пост-транскрипционного расщепления и сплайсинга Осуществляет транскрипцию митохондриальных генов ядерная РНК-полимераза, которая чрезвычайно похожа на РНК-полимеразу бактериофагов Т7, Т4 и SP6 Трансляционные синтезы в митохондриях растений происходят при участии третьего клеточного генома - хлоропластного, а именно – необходим экспорт ряда пластидных тРНК, не кодируемых митохондриальными генами

46. Регуляция трансляции митохондриального генома дрожжей изучена наиболее подробно Трансляционный аппарат митохондрий грибов кодируется в основном ядерными генами: 77 рибосомальных белков, тРНК-синтетазы, гомологи бактериальных факторов элонгации Tu и G КАК митохондриальные рибосомы дрожжей идентифицируют инициирующие кодоны??? неясно Рибосомы митохондрий дрожжей не сканируют мРНК в поисках инициирующего кодона, подобно цитоплазматическим. Нет никаких указаний, что в данной системе задействованы последовательности Shine-Dalgarno

47. Необычной чертой трансляционной системы митохондрий дрожжей являются специфические белки-активаторы: именно они взаимодействуют с 5’-UTR областями митохондриальных транскриптов и играют решающую роль в регуляции трансляции. Такие активаторы кодируются ядром и обнаружены почти для всех генов, транслируемых на митохондриальных матрицах

48. Общая картина регуляции экспрессии митохондриального генома пока отсутствует • Неясно, • чем объясняются различия количества транскриптов с разных участков одной полицистронной матрицы • как координируются процессы транскрипции и трансляции в митохондриях, • как активируется трансляция мтДНК специфическими белками.