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主编 李桂源

主编 李桂源. 中国科学院教材建设专家委员会规划教材！. 全国高等医药院校规划教材！. 第四篇 肿瘤分子生物学. 第 19 章 肿瘤蛋白质组学. 杨静 博士. 二 0 一二年六月 长沙. 肿瘤蛋白质组学. 蛋白质组学的概念及其发展史 蛋白质组学的研究方法 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 血液肽组学. 蛋白质组学的概念 :. 人类基因组序列图谱初稿的公布，在揭示基因组的精细结构的同时，也凸显出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性。

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  1. 主编 李桂源

  2. 中国科学院教材建设专家委员会规划教材！ 全国高等医药院校规划教材！

  3. 第四篇 肿瘤分子生物学 第19章 肿瘤蛋白质组学 杨静 博士 二0一二年六月 长沙

  4. 肿瘤蛋白质组学 • 蛋白质组学的概念及其发展史 • 蛋白质组学的研究方法 • 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 • 血液肽组学

  5. 蛋白质组学的概念: • 人类基因组序列图谱初稿的公布，在揭示基因组的精细结构的同时，也凸显出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性。 • 基因组学虽然在基因活性和疾病的相关性方面为人类提供了有力根据，但是基因的表达方式错综复杂，同样的一个基因在不同条件、不同时期可能起到完全不同的作用。 • 研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是不够的，还须对生命活动的执行者——蛋白质进行更深入的探讨。 • 对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务，一个以“蛋白质组”为研究对象的生命科学新时代已经到来。

  6. 蛋白质组学的概念: 由澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出 . “蛋白质组”一词的英文是PROTEOME，它由PROTEins和genOME两个词组合而成，意思是proteins expressed by a genome，即基因组所表达的全部蛋白质。 广义上讲，蛋白质组是指“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。 狭义上讲，蛋白质组是指不同条件下细胞内蛋白质的变化（比如正常细胞和异常细胞之间，细胞用药和不用药之间的蛋白质表达谱的差别等）

  7. 蛋白质组学的概念: 要对“全部蛋白质”进行研究是非常困难的，“功能蛋白质组学（functional proteomics)的提出解决了这一难题 功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质 它是介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学研究之间的层次，并把目标定位在蛋白质群体上，从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体，逐步描绘出接近于生命细胞的”全部蛋白质“的蛋白质组图谱。

  8. 蛋白质组学的产生与发展： • 1994年，澳大利亚学者Williams和Wilkins首先提出与基因组相对应的“蛋白质组”概念。 • 1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心。 • 同年，丹麦、加拿大也先后成立了国家蛋白质组研究中心。 • 随后，多个国家加入了蛋白质组研究行列。 • 1997年，召开了第一次国际蛋白质组会议，预测21世纪生命科学的重心将从基因组学转移到蛋白质组学，为生命科学和医药学领域的研究带来了新的生机。 • 2001年，国际人类蛋白质组组织成立，提出人类蛋白质组计划，相继启动几个重大国际合作项目。

  9. 蛋白质组学的产生与发展（我国）： • 1998年启动蛋白质组学研究； • 2002年首次牵头组织了人类肝脏蛋白质组计划这一重大国际合作项目； • 2003年成立了中国人类蛋白质组组织，同年召开了首届中国蛋白质组学大会； • 2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议； • 我国在鼻咽癌、肝癌、肺癌、食管癌和白血病蛋白质组研究方面取得了较大进展。

  10. 蛋白质组表达模式的研究方法 样 品 制 备 • 组织细胞的破碎裂解； • 缓冲液的选择； • 蛋白质增溶溶解以破坏蛋白质与蛋白质分子之间及蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用； • 变性及还原； • 去除非蛋白质组分如核酸、脂类等。

  11. 蛋白质抽提的原则 蛋白质组表达模式的研究方法 • 尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合，使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在； • 避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用； • 避免脂类、核酸和盐等物质的干扰作用； • 蛋白质样品与第一向电泳的相容性； • 对临床组织样品的蛋白质的纯化一定要保持其组织细胞的纯净性，如肿瘤组织中总是与血管、基质细胞等混杂。

  12. 组织细胞蛋白质样品的制备 待提取的样品(如肝脏、心脏等）洗去表面血液及其他体液 • 蛋白质一步提取法： 样品切成小块并置于液氮中冻结 于研钵内加裂解液研磨 超声波破碎处理 离心，取上清，-70℃保存备用

  13. 第一步：细胞裂解，以Tris碱抽提细胞中的可溶性蛋白质第一步：细胞裂解，以Tris碱抽提细胞中的可溶性蛋白质 • 蛋白质分步顺序提取法：（疏水性蛋白质、低丰度蛋白质） 第二步：第一步未溶解的细胞沉淀用常规的IEF样品液进行抽提，富集膜蛋白 脲、CHAPS 第三步：采用更有效的表面活性剂及还原剂进行抽提，使不溶性蛋白质溶解 脲、硫脲、CHAPS、SB3-10、TBP 如有必要可进行第四步抽提:使与细胞膜或细胞器中结合很牢的常规提取不能溶解的膜蛋白质，不溶性蛋白质溶解 SDS、甘油、Tris

  14. 细胞蛋白质样品的制备 培养细胞去掉培养基 • 培养细胞总蛋白质的提取 预冷的PBS漂洗3次 酶消化，收集细胞于EP管中 于瓶中加裂解液，冰上放置30分钟 加裂解液重悬细胞，冰上放置30分钟 收集于EP管中 超声进一步破碎细胞，离心，取上清

  15. 细胞蛋白质样品的制备 细胞匀浆 • 亚细胞器蛋白质的提取 差速离心：1000g,沉淀部分为细胞核；3000g，沉淀部分为线粒体；16300g，沉淀部分为溶酶体，上清液为内质网和核糖体部分 密度梯度离心：500g,沉淀部分为细胞核；15000g，沉淀用不同浓度蔗糖离心获得纯化的质膜 加裂解液重悬细胞 收集于EP管中 超声破碎细胞，离心，取上清

  16. 细胞蛋白质样品的制备 • 细胞膜蛋白质的提取: • 存在于细胞膜或有关细胞器如线粒体、内质网、细胞核等的膜上，可分为外周蛋白及固有蛋白。 • 外周蛋白：用含EDTA二钠的缓冲液抽提。 • 固有蛋白：因其嵌合在脂双层中，抽提时要削弱它与膜脂的疏水相互作用，因此要通过增溶溶解。常用的去污剂：SDS 、TritonX-100 、NP-40 、CHAPS 、SB3-10 、ASB等。

  17. 细胞蛋白质样品的制备 • 体液蛋白质（如：血清、血浆、脑脊液、尿液等）: • 体液蛋白质分析对于研究疾病的发病机理、疾病诊断、癌细胞转移及治疗都有重要意义。 • 绝大多数都属可溶性蛋白质，但也需要做适当处理和增溶溶解，除去电泳的干扰物才能获得准确的和重复性好的结果。 体液蛋白质样品的制备原则： • 尽可能地溶解更多的蛋白质。 • 必须打断蛋白质的聚合，避免形成点的条纹。 • 样品制备需重复性好，以免产生错误结果。

  18. 样 品 制 备 • 肿瘤组织总蛋白质的抽提： • 肿瘤组织成分具多样性，且标本的获取过程要考虑多方面的影响因素，如血液、结缔组织等，它们都含有丰富的蛋白质，对所需的目的蛋白质会起到干扰作用，故在取材时需尽可能去除间质成分，并对取得的标本进行清洗以去除血液等。 • 可采用荧光标记的流式细胞仪或激光捕获显微切割术进行取材，从而获得纯净的蛋白质样品。 • 要避开肿瘤组织坏死的部位（多在肿瘤的中央）。

  19. 常见蛋白质样品中的污染物及其影响与去除方法常见蛋白质样品中的污染物及其影响与去除方法

  20. 肿瘤蛋白质组学研究方法 凝胶路线 非胶路线 样品（实验组和对照组） 2D-gel SILAC ICAT iTRAQ 2D-PAGE 2D-DIGE ESI源质谱检测 MALDI源质谱检测

  21. 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 简介： • 是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。 • iTRAQ试剂盒包括八种同量的胺活性试剂，能对蛋白质水解的肽段进行标记，因此采用串联质谱方法，可以对肽段进行精确的鉴别和定量。 • 能够得到：一般500至600种蛋白，以及不同样品间蛋白质表达的差异。

  22. 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 应用： • 同时标记8个样品，一次实验实现多大8个样品的蛋白质鉴定和定量 • 可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测 • 可以分析详细分期/型的临床疾病样本，并看设计样本重复 • 甚至可以进行个体样本的研究 • 细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学

  23. 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 技术特点和优势： • 定量敏感、反应速度快 • 标记完全，标记效率高（达97%以上） • 较高的重复性，能简化图谱的复杂程度、提高离子强度 • 可对多达八种不同样本同时进行定量分析 • 定性与定量同时进行

  24. 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 原理： iTRAQ试剂包含八种不同的胺活性试剂。每种胺活性试剂与水解后肽段结合。 胺活性试剂包含报告基团和平衡基团。

  25. 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 对加入标记的肽段进行二级质谱，平衡基团从报告基团上脱落 8个不同来源的同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个峰 不同的蛋白质样本用胰蛋白酶水解 对酶解肽段进行标记 混合并做一级质谱 实验流程： 报告基团在二级质谱低质量区域产生8个报告离子信号，其强度分辨代表8个标记样本的同一肽段 报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值

  26. ﹙2﹚对一级质谱的每个峰进行二级质谱（MS/MS):(黄色部分为报告基团的峰，因为横坐标比较大，没显示出多条峰）﹙2﹚对一级质谱的每个峰进行二级质谱（MS/MS):(黄色部分为报告基团的峰，因为横坐标比较大，没显示出多条峰） 对质谱仪所得的数据进行生物信息学分析，定性和定量研究

  27. 样 品 分 离——蛋白质双向凝胶电泳分离技术 蛋白质组表达模式的研究方法 • 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2DE)是最主要的基于胶的蛋白质组学分离技术 • 第一向，根据不同蛋白质分子所带电荷量的差异，以等电聚焦技术进行分离 • 第二向，根据蛋白质的分子量不同，通过SDS凝胶电泳进行分离 • 分辨率高，应用广泛 双向电泳技术可分离几千个蛋白质点!

  28. 平 衡： • 第一向IEF电泳结束后，需向第二向SDS电泳转移。 • 在转移前都需要经过第二向SDS电泳分离系统溶液进行平衡。 • 目的：通过平衡液中的DTT或β-巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质的充分结合。另外，使等电聚焦凝胶中的两性载体电解质或固相pH梯度IEF中水化液成分及高浓度的脲扩散出凝胶，并使经聚焦的胶条为第二向浓缩胶缓冲液所平衡，有利于蛋白质从第一向向第二向的转移。

  29. 双向凝胶电泳的工作范围 疏水性 14 13 106 12 11 10 9 8 105 7 等电点 分子量 6 5 4 104 3 2 1

  30. 样 品 分 离——双向凝胶电泳 蛋白质组表达模式的研究方法 • 缺陷性：极酸极碱性蛋白质、疏水性蛋白质、极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此技术难以有效分离。 • 此技术路线采用的胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱联用实现自动化。

  31. 样 品 分 离 蛋白质组表达模式的研究方法 • 为弥补双向凝胶电泳技术的缺陷，促进蛋白质组学研究，目前发展了许多新型高分辨率、高通量、高峰容量的分离分析的非凝胶技术，如液相色谱法、毛细管电泳技术等； • 这些技术简化了蛋白质组研究步骤，又可与质谱联用实现自动化，是2DE技术路线的有效补充。

  32. 凝 胶 染 色 方 法： CBB R250:考染灵敏度为30-100ng，线性范围是10-30倍 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为8-10ng 银染的灵敏度是ng级，线性范围是10倍；银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响 负染：常用KCl，CuCl2和ZnCl2三种。其中ZnCl2-Imidazole灵敏度最高，10-20ng。线性范围是10倍 荧光染料：尼罗红(Nile Red), Sypro Orange/Red/Tangerine/Ruby Sypro Ruby:灵敏度是ng级，线性范围是1000倍以上 Deep Purple: 比Sypro Ruby灵敏8倍，无染色颗粒，信噪比高，和质谱及测序兼容……

  33. 蛋白质考马斯亮蓝染色方法一 • 染色液：0.1%考马斯亮蓝R250，25%甲醇，10%冰乙酸 脱色液：25%甲醇，10%冰乙酸 • 染色3-4小时或过夜，然后换脱色液脱色至背景清晰为止。

  34. 蛋白质银染色方法一

  35. 扫 描： 用于考染、银染凝胶扫描 用于荧光染凝胶扫描

  36. ImageMaster 2D 软件 用于考染、银染凝胶图像差异分析 用于荧光标记凝胶图像差异分析 Decyder 软件

  37. 普通双向电泳面临的挑战 难以呈现高分子量和小分子量的蛋白 难以呈现疏水性蛋白 难以呈现极酸性和极碱性蛋白 难以呈现低丰度蛋白 胶间差异：蛋白点位置，丰度等

  38. 想寻找真正的差异？

  39. 解决方案是之一－DIGE－荧光差异蛋白质表达分析系统解决方案是之一－DIGE－荧光差异蛋白质表达分析系统

  40. 2D-DIGE的概念 2-Dimentional fluorescence DIfference Gel Electrophoresis

  41. 能否针对普通双向电泳的缺陷加以解决？ 难以呈现高分子量和小分子量的蛋白 难以呈现疏水性蛋白 难以呈现极酸性和极碱性蛋白 难以呈现低丰度蛋白 胶间差异：蛋白点位置，丰度等 √ √ √ √

  42. 2D-DIGE概述: 在2D电泳前用荧光染料标记蛋白样品 引入内标 在同一块胶上可同时分离多至三种不同的蛋白样品 样品需要量少

  43. CyDye DIGE 染料的特点： 大小和电荷匹配 pH不敏感（pH8.0-9.0，8.5最佳） 光谱不重叠 灵敏度高（可以检测低至125pg的转铁蛋白） 光稳定性好

  44. CyDyeTM DIGE 最小比例标记荧光标记物 3 种荧光标记染料：Cy2, Cy3, Cy5 标记赖氨酸的 ε-amino 基团 携带 +1 电荷 ~3% 的赖氨酸被标记 分子量匹配 (~450Da) 经过不同荧光标记染料标记的同一蛋白分子量改变是一致的 检测灵敏度 = 125 pg 蛋白

  45. EttanTM DIGE minimal dye workflow Check pH Quantify Pellet and extract Sonicate in Adjust if Require 5-10 mg/ml supernatant lysis buffer necessary Step 1 Extract Proteins Step 2 Label proteins

  46. 用Typhoon 扫描仪得到的三色图像 Cy2 Internal Standard Cy™3 control sample Three color overlay inverted colors Cy5 treated sample

  47. 图像分析DeCyderTM 2D software

  48. 2-D DIGE –内标 什么是内标? 内标：即内部参照，是将实验中的每种样品等量混合而成，并且上样至每一块凝胶中用做参照。 C1 C2 C3 T4 T5 T6 Pooled sample (internal standard)

  49. 内标的意义: Every protein in the population should appear on each gel Simplifies gel to gel matching Enables fully automated, accurate spot statistics Each sample is compared internally to the same standard Decreased gel to gel variation Able to address experimental and biological variation

  50. 2-D DIGE 与经典的二维凝胶电泳在方法学上的区别

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