Soutenance de thèse de Biologie

1. Soutenance de thèse de Biologie Cécile Lestrat Université Joseph Fourier Grenoble Directeur de Thèse: Cécile Caron Institut Albert Bonniot Ontogenèse et Oncogenèse Moléculaire Financé par La Région Rhône-Alpes Et l’ARC

2. Identification et caractérisation de la protéine Atad2 Un facteur impliqué dans le remodelage de la chromatine acétylée au cours de la spermiogenèse 16 Octobre 2008

3. Sommaire Introduction • La chromatine • Le Bromodomaine • Les protéines à bromodomaines • Autres machineries: Les AAA-ATPases • Problématique de recherche Résultats • Présentation d’Atad2 • Atad2 et la spermiogenèse • Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe Conclusion et Perspectives

4. Sommaire Introduction • La chromatine • Le Bromodomaine • Les protéines à bromodomaines • Autres machineries: Les AAA-ATPases • Problématique de recherche Résultats Conclusion et Perspectives

5. Les différents degrés de l’organisation de la chromatinienne ADN double brin (2 nm) ’’collier’’ de nucléosome (11 nm) Fibre de chromatine (30 nm) Section chromosomique sous sa forme étendue (300 nm) Section condensée de la chromatine (700 nm) Chromosome mitotique entier (1400 nm) Felsenfeld & Groudine, 2003

6. Nucléosome H2B H2A H3 H4 H3 H4 H2B H2A La structure chromatinienne

7. N- PEPVKSAPVPKKGSKKAINK…..VKYTSSK…. Epigénétique et code histone Ub H2A N- SGRGKQGGKARA…..AVLLPKKTESHHK…. Me H2B P H3 Ac N- ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP….. H4 N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGIT….

8. HAT (Histones acétytransférases) CoA CH3-CO-SCoA Structure fermée (Transcription réprimée) Structure ouverte (Transcription activée) HDAC (Histones déacétylases) Machinerie de remodelage Exemple de l’acétylation

9. Sommaire Introduction • La chromatine • Le Bromodomaine • Les protéines à bromodomaines • Autres machineries: Les AAA-ATPases • Problématique de recherche Résultats Conclusion et Perspectives

10. :Ac Bromo N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV... H4 Les bromodomaines: Conservation et structures Zeng & Zhou, 2002

11. :Ac Bromo N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV... H4 Les bromodomaines: reconnaissance des histones acétylées Reconnaissance des lysines acétylées Spécificité de la reconnaissance: chaque bromodomaine ne reconnait pas toutes les lysines acétylées Affinité expliquée par l’environnement du site de liaison (au niveau des acides aminées non conservés, de la conformation de la protéine)

12. Sommaire Introduction • La chromatine • Le Bromodomaine • Les protéines à bromodomaines • Autres machineries: Les AAA-ATPases • Problématique de recherche Résultats Conclusion et Perspectives

13. Les protéines à bromodomaines Les Histones AcetylTransferases (HAT) Famille SWI/SNF HAT, reconnaissance des histones acétylées et extension du signal au nucléosome suivant Facteurs de remodelage dépendantes à l’ATP De la Serna, Ohkawa & Imbalzano, 2006.

14. Sommaire Introduction • La chromatine • Le Bromodomaine • Les protéines à bromodomaines • Autres machineries: Les AAA-ATPases • Problématique de recherche Résultats Conclusion et Perspectives

15. Les AAA-ATPases ATPases Associated with a wide variety of cellular Activities VCP AAA Anneauxhexa/heptamériques Implication dans le désassemblage de complexes multiprotéiques Boucle Pore SRH Walker A Walker B Hanson and Whiteheart, 2005; Lenzen et al.,1998

16. Conservation des AAA-ATPases VCP AAA Homologue d’Atad2 Sous-unités Rpt du protéasome Homologues de VCP

17. Les AAA-ATPases VCP AAA Hexamérisationen anneaux, dépliementdes protéinesneo-synthétiséesmal repliées.. VCP Particule19S sous-unités du protéasome (dégradation des protéines) Hexamèreschargés du dépliement des protéines à dégrader Particule20S Particule19S Rpt protéasome

18. AAA: Le protéasome Dégradation des protéines 19 S : reconnaissance du substrat, dépliement et insertion dans la chambre catalytique 20 S: chambre catalytique, site de coupure des séquences peptidiques 19 S Rechsteiner & Hill, 2005

19. Les AAA et l’activité génomique Helicases mcm2-mcm7 (minichromosome maintenance 2-7) Initiation et élongation de la réplication de l ’ADN Rpt Coactivatrice traductionnelles (GAL) Dégradation des facteurs de transcription et modifications post- traductionnelles des histones Etapes de la transcription

20. Sommaire Introduction • La chromatine • Le Bromodomaine • Les protéines à bromodomaines • Autres machineries: Les AAA-ATPases • Problématique de recherche Résultats Conclusion et Perspectives

21. Remodelage chromatinien et spermatogenèse Compaction Arrêt de la transcription

22. protamines Nucléosome H2B H2A H3 H4 H3 H4 H2B H2A Enlèvement des histones Méiose ? ?

23. Organisation finale dugénomespermatique Mécanismesmoléculairesdu remodelage Mécanismesmoléculairesdu remodelage Axes de recherche de l’équipe Recherchefondamentale Transfert au niveaumédical - Département de Génétique et procréation/CECOS - Exploitation des connaissances en physiopathologiehumaine (procréation) Exploitation des connaissances en oncologie

24. ? Spermiogenèse CDYL BRDT Atad2 Identification Criblage bio-informatique d’ unebanqued’ADNc : • Banquetesticulaire • Candidat liant la chromatine • Candidatayantune possible activitéenzymatique Caron, Pivot-Pajot, van Grunsven, Col, Lestrat, Rousseaux, Khochbin; EMBO Rep 2003 Pivot-Pajot, Caron,Govin, Vion, Rousseaux, Khochbin; MCB 2003

25. Sommaire Introduction Résultats • Présentation d’Atad2 • Atad2 et la spermiogenèse • Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe Conclusion et Perspectives

26. Sommaire Introduction Résultats • Méthodes d’identification • Présentation d’Atad2 • Atad2 et la spermiogenèse • Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe Conclusion et Perspectives

27. AAATPase Bromodomaine :Ac Bromo N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV... H4 Atad2 114 631 743 1040 1 255 Remodelage? Reconnaissance des histonesacétylées ?

28. Atad2 & conservation mAtad2-s mAtad2-l ratAtad2 humainAtad2 C. elegans A.thaliana1 A.thaliana2 S. Cerevisiae

29. Sommaire Introduction Résultats • Présentation d’Atad2 • Atad2 et la spermiogenèse • Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe Conclusion et Perspectives

30. Hypothèse de travail Spermiogenèse protamines Enlèvement des histones? Dégradation des histones?

31. Sommaire Résultats • Méthodes d’identification • Présentation d’Atad2 • Atad2 et la spermiogenèse Profil d’expression Bromodomaine Domaine AAA-ATPase • Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe

32. Existence d’Atad2,profil d’expression • RT-PCR long court Glandesalivaire Sans ARN Testicule Embryon Poumon Cerveau Uterus Coeur Rate Rein Foie Oeil 7 11 15 17 Atad2 GAPDH Les deux formes d’Atad2 existent chez la souris La forme courte est strictement testiculaire

33. Existence d’Atad2,profil d’expression • Western-blot PM (Kda) Spermiogenèse Testicule Poumon Cerveau Muscle PM (Kda) Coeur Rate Rein Foie long 180 180 130 130 100 court 73 Les deux formes d’Atad2 sont présentes au cours des phases tardives de la spermiogenèse

34. Sommaire Résultats • Méthodes d’identification • Présentation d’Atad2 • Atad2 et la spermiogenèse Profil d’expression Bromodomaine Domaine AAA-ATPase • Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe

35. :Ac Bromo N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV... H4 Les bromodomaines CBP bromodomain AAATPase Bromodomaine Atad2 Motifs de reconnaissance des histonesacétylées

36. Nucléoplasme Chromatine Cytoplasme Extraction saline 200 350 500 750 [KCl] (mM) Sol Son C Sol Son C Sol Son C Sol Son C long long court court Histones de coeur Histones de coeur Localisation subcellulaire PM (Kda) PM (Kda) 180 180 130 130 Atat2 dans la fraction chromatinienne Affinitédifférente des deuxformes pour la chromatine

37. Liaison à la chromatine Quelle affinité avec les histones? Tests de pull down sur la protéine endogène utilisant des peptides mimant les queues N-Terminales des histones SGLGKQGGKARAC H2A ? PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQC SGLGKQGGKARAC H2B PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQC ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAC H3 ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAC H4 SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV

38. Liaison à la chromatine Peptides pull down d'extraitsnucléoplasmiquestesticulaires Résultats peptides H2A tat H2B H4 H3 input No - + - + - + - + - + Acetylation court Acetylationspécifique contrôles H4 input + - K5 K8 K12 K16 court Le bromodomaine d’Atad2 lie l’histone H4 acétylée, majoritairement sur la lysine K5 SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV

39. IP HA Atad2 HA mAtad2 - + + PM - - + TSA 35 25 Histones de coeur 16 10 HA Atad2 Implication du bromodomaine Tests d’immunoprécipitation de différentes constructions d’Atad2 court IP HA Atad2 - - + HA mAtad2 HA mAtad2 - + - PM + + + TSA 35 25 Histones de coeur 16 10 HA mAtad2 Affinité d’Atad2 avec la chromatine quand celle-ci est acétylée Le bromodomaine est responsable de cette interaction

40. Sommaire Résultats • Méthodes d’identification • Présentation d’Atad2 • Atad2 et la spermiogenèse Profil d’expression Bromodomaine Domaine AAA-ATPase • Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe

41. Atad2 sousunité du protéasome Atad2 Hexamère • Complexede remodelage • Extraction des nucléosomesacétylés • S’insère dans l’anneau Rpt • Recrute le protéasome sur la chromatine acétylée • Dégradation des nucléosomes acétylés Domaine AAA Hypothèses

42. Rpt protéasome Complexe 19S sous-unités du protéasome (dégradation des protéines) Hexamères chargés du dépliement des protéines à dégrader Rpt Complexe 20S Complexe 19S Interaction avec les Rpt AAATPase Bromodomaine ATPases Associated with a wide variety of cellular Activities Anneaux hexamériques Chaperonnes: désassemblage de complexes multiprotéiques

43. Interaction avec les Rpt 1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV 2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes 3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol

44. Pull down Input Rpt 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 - + - + - + - + - + - + Tests in Vitro Pull down des Rpt traduitesin vitro sur des bille GST / GST-Atad2, domaine ATPase Interactions in vitro

45. Interaction avec les Rpt 1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV 2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes 3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol

46. - + Input 5% Atad2 c Rpt1 Rpt6 Co-immunoprécipitation Avec des Rpt surexprimées de façontransitoire Avec des Rpt endogènes Rpt Rpt Rpt1 IP Rpt1 Input Rpt1 Rpt3 IP Rpt3 Interaction entre les Rpt et Atad2 via son domaine AAA Input Rpt3

47. Interaction avec les Rpt 1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV 2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes 3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol

48. SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV Ultracentrifugation Méthodesde séparation testicule 3 - Centrifugation sur gradient de densité Glycerol 20% 4 - AcH4 peptide pulldown 1 - Noyaux 2 - Extrait soluble 40%

49. Rpt1 Rpt1 Ultracentrifugation Résultats Atad2 Fraction Atad2 Pull down ? Colocalisation de la population d’Atad2 en complexe et des Rpt

50. Atad2 sous-unitédu protéasome Atad2 Hexamère • Complexede remodelage • Extraction des nucléosomesacétylés • S’insère dans l’anneau Rpt • Recrute le protéasome sur la chromatine acétylée • Dégradation des nucléosomes acétylés Domaine AAA Hypothèses