Download
1 / 17
170 likes | 374 Views
модификация моноцитов периферической крови аденозином с целью повышения их регенеративного потенциала при аутологической трансплантации. м.н.с. ЦНИЛ Хворилова Ксения. Нейродегенеративные болезни. Актуальность. Аутоиммунная патология. Наследственные болезни.
E N D
модификация моноцитов периферической крови аденозином с целью повышения их регенеративного потенциала при аутологической трансплантации м.н.с. ЦНИЛ Хворилова Ксения
Нейродегенеративные болезни Актуальность Аутоиммунная патология Наследственные болезни Клеточная терапия Онкологическая патология Сердечно-сосудистая патология Ожоги
Актуальность • Клеточная терапия стволовыми клетками способствует восстановлению структуры ткани [Andrade C. et al., 2006; Baraniak P., McDevitt T., 2010]. • - Паракринные факторы, обеспечивающие эффект терапии, не являются уникальными для стволовых клеток и вырабатываются, хотя и в меньшей степени, также клетками периферической крови, которые при этом не обладают онкогенной активностью. • Широким спектром секретируемых цитокинов обладают моноциты. Их легко выделить из крови человека в количестве, достаточном для культивации и последующей аутологической трансплантации. • Аденозин (эндогенный нуклеозид), образующийся в повышенных количествах при повреждении ткани, в условиях воспаления и гипоксии, влияет на выработку паракринных факторов различными клетками, в том числе моноцитами.
Цель: • исследовать механизмы модификации моноцитов периферической крови аденозином и разработать подходы для усиления продукции моноцитами необходимых для регенерации тканей и органов паракринных факторов. • Задачи: • Определить уровень экспрессии мРНК 4 типов аденозиновых рецепторов в культурах стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов периферической крови для оценки характера ответа клеток на аденозиновую стимуляцию. • 2.Определить уровень экспрессии мРНК про- и противовоспалительных паракринных факторов в культурах стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов периферической крови. • 3. Определить секрецию про- и противовоспалительных паракринных факторов культурами стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов периферической крови. • 4.Осуществить экспериментальную оценку регенеративного потенциала модифицированных аденозином клеток в модели in vivo.
Дизайн исследования in vitro Определение титра IgE Забор крови у 40 здоровых доноров ИФА Выделение моноцитарной фракции Стимуляция и культивирование 24часа 72часа NECA 30мкМ DMSO NECA 100 мкМ DMSO Анализ полученных клеток Проточная цитофлюориметрия ИФА Real-time PCR
Результаты Иммунофенотип клеток * * * * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05)
Результаты Экспресиия мРНК аденозиновых рецепторов * * * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05)
Результаты Экспрессия паракринных факторов24 часа культивирования * * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05)
Результаты Экспрессия паракринных факторов72 часа культивирования * * * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05)
Результаты Секреция паракринных факторов 24 часа культивирования 72 часа культивирования * * * - статистически значимые различия по сравнению с показателями клеток , культивируемых с DMSO (p<0.05)
Дизайн исследования in vivo 36 мышей линии C57Bl/6JY 30 мышей Моделирование термического ожога 6 мышей Получение суспензии клеток костного мозга + NECA Введение физиологического раствора Введение модифицированных клеток Введение немодифицированных клеток + DMSO Гистологическая оценка образцов (5, 7, 14 сутки)
Результаты Гистологическая картина препаратов кожи на 5 сутки Физиологический раствор Немодифицированные клетки Модифицированные клетки
Результаты Гистологическая картина препаратов кожи на 7 сутки Физиологический раствор Немодифицированные клетки Модифицированные клетки
Результаты Гистологическая картина препаратов кожи на 14 сутки Физиологический раствор Немодифицированные клетки Модифицированные клетки
Выводы • Были обнаружены изменения в профиле аденозиновых рецепторов моноцитов периферической крови при стимуляции аналогом аденозина NECA: значительное повышение уровня экспрессии мРНК А2А и А3 аденозиновых рецепторов. • Модификация моноцитов периферической крови аденозином привела к статистически достоверному подъему уровней экспрессии генов IL-8, IL-10, IL-1b, bFGF, IP-10 и VEGF. • В ответ на стимуляцию аденозином наблюдалось увеличение уровня секреции моноцитами сосудисто-эндотелиального фактора роста. • При анализе функциональных особенностей модифицированных моноцитов было установлено, что наиболее эффективным для модификации моноцитов является режим, характеризующийся добавлением 100 мкм NECA и последующим культивированием в течение 72 часов (по сравнению со стимуляцией 30 мкм NECA с последующим инкубированием в течение 24 часов). • В экспериментах in vivo(моделирование ожогового повреждения) модифицированные аденозином клетки костного мозга показали положительный пролиферативный эффект на ангиогенез, фиброгенез и эпителизацию раневой поверхности.
Дизайн исследования in vivo 45 лабораторных животных Контрольная группа Опытная группа 1 Опытная группа 2 Забор крови Забор крови Забор крови Культивирование клеток Культивирование клеток + DMSO + NECA Введение физ. раствора в область ожога Введение клеток в область ожога Введение клеток в область ожога Вывод животных из эксперимента с последующей гистологической оценкой образцов (7, 14, 21 сутки)
