Emprego de marcadores moleculares (RAPD) no estudo genético de Ilex paraguariensis St. Hil.

1. Emprego de marcadores moleculares (RAPD) no estudo genético de Ilex paraguariensis St. Hil. Wendt, S. N.; Mazza, M. C.; Quoirin, M. G.; Sousa, V. A.; Sturion, J. A.

2. Introdução • Ilex paraguariensis • Pertence a família Aquifoliaceae • Brasil, Paraguai, Argentina e Uruguai • Arbórea, 12-30 m, perene (100 anos) • Diplóide (2n=40) e dióica (dioicia críptica) • Produção de bebidas, corante natural, conservante alimentar, medicamentos diversos, produtos de higiene e cosméticos. • Estudos genéticos e programas de melhoramento são escassos  conhecimento da diversidade genética: • planejamento dos programas de melhoramento • conservaçãode recursos genéticos

3. Marcadores moleculares • Detectam variabilidade genética ao nível de DNA. • RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) • Amplificação de segmentos de DNA ao acaso, utilizando um único primer, com 10 pb, cuja sequência nucleotídica é arbitrária • O primer dirige a síntese de vários segmentos de DNA em diversos pontos do genoma  várias bandas no gel • O polimorfismo tem natureza binária • Marcadores genéticos dominantes AA Aa aa

4. Objetivo Determinar a variabilidade genética de diferentes procedências de erva-mate, utilizando marcadores RAPD.

5. Materiais e métodos • Material vegetal • Folhas jovens de três procedências: Ivaí, Pinhão e Cascavel, do teste de procedências e progênies, localizado na Fazenda Vila Nova, Município de Ivaí. • 28 indivíduos/procedência. • Extração do DNA • 150 mg folhas • Protocolo modificado de Doyle & Doyle (1987) DOYLE, J.J., DOYLE, J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leal tissue. Phytochem. Bull., v. 9, p. 11-15, 1987.

6. Etapas da extração do DNA

7. Quantificação e diluição do DNA • Amplificação do DNA • Volume final de 13 l. • Componentes: DNA, H2O, tampão, MgCl2, dNTPs, primer, Taq polimerase • Etapas: - 15 s a 94 ºC - 30 s a 35 - 60 s a 72 ºC - 5 min a 72 ºC 40 ciclos

8. 15 primers Primer Sequência (5’  3’) OPA-01 CAGGCCCTTC OPA-02 TGCCGAGCTG OPF-01 ACGCATCCTG OPF-03 CCTGATCACC OPF-05 CCGAATTCCC OPF-14 TGCTGCAGGT OPH-03 AGACGTCCAC OPH-04 GGAAGTCGCC Primer Sequência (5’  3’) OPH-05 AGTCGTCCCC OPH-08 GAAACACCCC OPH-12 ACGCGCATGT OPH-13 GACGCCACAC OPH-15 AATGGCGCAG OPH-18 GAATCGGCCA OPH-19 CTGACCAGCC • Eletroforese em gel de agarose 1,6%, corado com brometo de etídeo. • Os géis foram visualizados em transiluminador de luz UV e fotografados.

9. Etapas da técnica RAPD

10. Análise dos dados • Os fragmentos foram tabulados como 1 para presença e 0 para ausência de banda no gel de eletroforese. Resultados • Perfil RAPD • Os 15 primers produziram 159 fragmentos, com o número de bandas produzidas por primer variando de 6 (OPH-19) até 13 (OPH-05), em média 10,6 bandas/primer. • 71,40% fragmentos polimórficos. • O tamanho dos fragmentos variaram de 110 a 1830 pb.

11. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 M Produtos da amplificação por RAPD de amostras da procedência Pinhão, usando o primer OPH-12. M = DNA Ladder 100 pb, 1-28 = Indivíduos da procedência Pinhão, Colombo-PR, 2001.