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RNA 干扰. Z Y H 华西医学中心微生物学 教研室 (内容主要来自本人一篇宗述). RNA 干扰 ( RNA interference , RNAi ). RNAi 是与靶基因序列同源的双链 RNA (dsRNA) 所诱导的一种特异性基因沉默现象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制,具有重大生物学意义。. RNAi 的发现简史.

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Presentation Transcript
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RNA 干扰

Z Y H

华西医学中心微生物学

教研室

(内容主要来自本人一篇宗述)

rna rna interference rnai
RNA 干扰(RNA interference,RNAi)

RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA

(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。

它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制,具有重大生物学意义。

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RNAi的发现简史
  • 90年代初,Rich Jorgensen 设想,将更多的色素基因注入植物体,能使花朵的色彩更艳丽,而结果出其预料,转基因的植株不仅没有新基因表达,反而使原有的色素基因也受到了抑制,当时称共抑制(cosuppression)。
  • 94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象,此称为基因压制 (quelling)。
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95年Guo和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达,给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达,反而产生与反义RNA 同样的结果——特异性阻断该基因的表达,从而正式表明RNA 干扰现象的存在。
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Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达,并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。

将制备的RNA高度纯化后发现,正义RNA无基因抑制作用,反义RNA的基因抑制作用也很微弱,而用纯化后的dsRNA注入线虫,却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量 ,他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰(RNAi)。图示

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Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos.

(A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.)

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RNAi现象的普遍性

随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。

RNAi能高效特异的阻断基因的表达,在线虫,果蝇体内,RNAi能达到基因敲除的效果。

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基因沉默

  • 转基因沉默分为转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS)和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)两种:
  • TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默;
  • PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录,但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。
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RNAi的作用机制

目前普遍认为,共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制,都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达。 即RNAi、共抑制、quelling均属于PTGS!现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步。

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第一步(起始阶段)是较长ds RNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。

siRNA的两条单链末端为5’-磷酸和3’-羟基,且3’端均有2~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。

Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。

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第二步(效应阶段)是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)。

RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA,并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA,最后可能再被核酸外切酶进一步降解,从而干扰基因表达。

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RNAi途径主要存在于细胞浆中,但是siRNA产生、靶mRNA降解的亚细胞位置尚未明确。外源性(注射或喂养)的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接进入细胞浆中的RNAi途径,仅在细胞浆中复制的RNA病毒可被dsRNA介导的沉默机制所抑制。外源性dsRNA则还可导致细胞核中的同源早期RNA转录产物减少。RNAi途径主要存在于细胞浆中,但是siRNA产生、靶mRNA降解的亚细胞位置尚未明确。外源性(注射或喂养)的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接进入细胞浆中的RNAi途径,仅在细胞浆中复制的RNA病毒可被dsRNA介导的沉默机制所抑制。外源性dsRNA则还可导致细胞核中的同源早期RNA转录产物减少。
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在许多机体中反向重复转基因序列在细胞核内转录成发夹dsRNA,进而可介导RNAi,这种dsRNA可能需要转移至胞浆中才可有效地沉默同源靶mRNA。在许多机体中反向重复转基因序列在细胞核内转录成发夹dsRNA,进而可介导RNAi,这种dsRNA可能需要转移至胞浆中才可有效地沉默同源靶mRNA。

例如,在果蝇中,转录含有内含子和多聚腺苷酸信号的发夹dsRNA的反向重复转基因序列比转录不含内含子、不含多聚腺苷酸信号dsRNA的转基因序列更能有效地沉默同源靶mRNA(因为内含子和多聚腺苷酸信号有利于dsRNA转移入胞浆)。

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另外,内源性的小的短暂RNA(small temporal RNA,stRNA,为一种修饰后的miRNA)也可作为siRNA发挥基因沉默作用。stRNA(miRNA)是~70nt发夹RNA (发夹miRNA 前体,miRNA hair precursor)被RNaseⅢ样核酸酶切割加工成的单链~22nt RNA。由于stRNA与靶基因不完全互补,它从翻译水平阻抑基因表达。
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RNAi的放大效应机制

siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA,而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。

新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程,进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR(random degradative PCR)。

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RNAi降解mRNA的过程

外源dsRNA

dsRNA

核酸酶

21-23nt dsRNA-核酸酶

RISC

mRNA

链互换

正义RNA 反义RNA-mRNA-核酸酶

mRNA降解

RNAi 或 PTGS

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RNAi的特点
  • 转录后水平的基因沉默
  • 较高特异性:能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。
  • 高效性:相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制。
  • 可遗传性及远距离效应:RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限,可传递给子一代。
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哺乳动物细胞中的RNAi技术

长链dsRNA所致的非特异干扰素效应:

科研人员开始试图将RNAi技术应用于哺乳动物细胞时,发现长链dsRNA(>30bp)并未引起特异序列的靶基因沉默,而是激活一组导致细胞死亡的非特异干扰素效应。

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目前研究认为这种非特异效应可能是由于长链dsRNA促使干扰素合成并激活了两种酶:目前研究认为这种非特异效应可能是由于长链dsRNA促使干扰素合成并激活了两种酶:
  • dsRNA依赖的蛋白激酶(dsRNA-dependent protein kinse,PKR),PKR可磷酸化转录起始因子eIF2a;
  • 2’,5’寡腺苷酸合成酶,其催化合成的2’,5’寡腺苷酸会激活RNase L。RNase L能够非特异地水解所有的mRNA。干扰素可加剧以上两种酶促反应,最终导致蛋白合成终止、诱发细胞凋亡。
21nt sirna
~21nt siRNA介导特异靶基因沉默

近来研究发现通过导入~21nt的siRNA可在哺乳动物中介导序列特异的基因沉默 。这些siRNA长至可诱导特异基因沉默,短至可逃避宿主的非特异干扰素效应。 Harborth等曾用体外化学合成的21nt siRNA沉默靶基因成功。但因化学合成的RNA易被RNase降解而且成本昂贵,目前主要转向研究利用DNA载体在细胞内合成siRNA。

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质粒载体表达合成siRNA的方法

第一种是设计可自然形成发夹的RNA(~22nt):

两种RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)启动子(U6或H1)控制一段反向重复序列(中间被可变间隔序列分开)转录,结果可在胞内合成具有发夹结构的双链RNA(含19~29nt的茎和3~9nt的环),其中19~29nt的茎与靶基因序列互补。另外,此发夹RNA的3’末端含有4个或4个以下的尿嘧啶。实验证实, 3’末端为UU的RNA较AA、CC或GG为末端的RNA更能有效地诱导基因沉默。

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第二种是将两个U6启动子串联在一起或置于两个分开的载体中以引导19nt的siRNA正义和反义链转录,正义、反义链在体内退火连接成双链siRNA。此siRNA中所含的19nt序列与靶基因互补,且siRNA的3’末端亦含4个或4个以下的尿嘧啶。第二种是将两个U6启动子串联在一起或置于两个分开的载体中以引导19nt的siRNA正义和反义链转录,正义、反义链在体内退火连接成双链siRNA。此siRNA中所含的19nt序列与靶基因互补,且siRNA的3’末端亦含4个或4个以下的尿嘧啶。
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虽然由于内源性stRNA(miRNA)与靶基因不完全互补,它从翻译水平阻抑基因表达,但研究发现人工设计的与靶基因完全互补的修饰后的miRNA则可同siRNA一样在转录水平沉默基因,因此我们通过人工设计表达miRNA发夹前体(~70nt)的质粒载体也是RNAi技术的另一种方法。虽然由于内源性stRNA(miRNA)与靶基因不完全互补,它从翻译水平阻抑基因表达,但研究发现人工设计的与靶基因完全互补的修饰后的miRNA则可同siRNA一样在转录水平沉默基因,因此我们通过人工设计表达miRNA发夹前体(~70nt)的质粒载体也是RNAi技术的另一种方法。
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RNAi—生物技术的蓝月亮
  • 基因治疗:RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因,但又不影响正常的等位基因。
  • 肿瘤的基因治疗:肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果,传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一序列的dsRNA分子,只导入一种dsRNA 既可以产生多个基因同时沉默。
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研究基因的功能:由于RNAi 可以特异性抑制特定的基因,获得功能丧失,因此可用于功能基因组的研究(类似Gene knock out)。图示
  • 防御病毒的感染:RNAi具有对抗侵入性遗传因子(如病毒、转座子、转基因)的作用、打破其复制循环、减弱或消除其基因毒性作用 。由于RNAi也存在于哺乳动物细胞中,RNAi或许可被利用来治疗病毒性疾病。
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为筛选在Hedgehog通路中表达的基因,Philip Beachy等合成了与已知的果蝇基因对应的双链RNA分子。通过系统地抑制特异RNA分子,然后激活Hedgehog通路,研究人员就可以查明一个基因是否是该通路执行功能所必需的。在果蝇胚胎中,Hedgehog通路的正常模式(上)被RNAi抑制,产生了一连串的基因过量表达(下)。返回

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RNAi的抗病毒治疗作用研究

RNAi与人类免疫缺陷病毒

Hela衍生细胞系Magi-CCR5可表达人的CD4、CXCR4(亲T细胞HIV的辅助受体)及CCR5(亲巨核细胞HIV的辅助受体)。实验中转染CD4-siRNA 三天后CD4-mRNA大约降低8倍,而后再用亲巨核细胞的HIV-1 R5(BAL)和亲T细胞的HIV-1 X4(NL43)株侵染,侵染48小时后检测表明CD4表达降低8倍导致病毒侵入减少4倍。

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体内CD4沉默可能受限于它在正常免疫功能中的作用,HIV的辅助受体为我们提供了更佳的选择。由于CCR5纯合子突变并不引起人的免疫功能严重损害,却可有效防御HIV-1感染,所以CCR5可能成为RNAi的理想靶点。体内CD4沉默可能受限于它在正常免疫功能中的作用,HIV的辅助受体为我们提供了更佳的选择。由于CCR5纯合子突变并不引起人的免疫功能严重损害,却可有效防御HIV-1感染,所以CCR5可能成为RNAi的理想靶点。

Martinez等研究表明,以CXCR4- siRNA转染 CXCR4+-U87-CD4+细胞,48h后细胞CXCR4表达减少到63%,而CCR5- siRNA转染 CCR5+-U87-CD4+细胞可使CCR5表达降低到48%。 CXCR4、CCR5的表达降低有效地抑制CXCR4+的U87-CD4+细胞被X4(NL43)HIV感染、有效地抑制CCR5+的U87-CD4+细胞被R5(Bal)HIV感染。

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Suppression of CXCR4 by short-interfering RNA. HeLa-green fluorescent protein (GFP) cells were mock transfected (control) or transfected with a short-interfering RNA (siRNA) directed to CXCR4 (RNAX42i). After 48 h, cells were labelled with anti-CXCR4 monoclonal antibody (12G5) and a secondary rhodamine-conjugated antibody and visualized in a Nikon fluorescence microscope. CXCR4 and GFP expression were quantified by flow cytometry analysis. Mean fluorescence intensity (MFI) values are shown.

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RNAi与肝炎病毒

Shlomai 和 Shaul 设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体:pSUPER X-siRNA和pSUPER core-siRNA。已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体的Huh7细胞再被 X-siRNA或 core-siRNA转染后,core蛋白水平分别降低了89%、63%,转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%,但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响(X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物,而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA)。

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另外,Randall等证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍;将 siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞,siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用;siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。
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RNAi与其它病毒
  • Hu WY等证明了siRNA能阻抑逆转录Rous 肉瘤病毒(RSV)感染脊椎动物;
  • Leonid等发现针对脊髓灰质炎病毒中编码衣壳蛋白或编码病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒复制,加速清除受染细胞中的脊髓灰质炎病毒;
  • Jia等发现Rta-siRNA( Rta是疱疹病毒基因表达的一种起始转录因子)和ORF45-siRNA能特异阻止疱疹病毒复制。
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问题与展望

RNAi是近年来才发现的一种古老的、保守的生物途径,是生物体适应外界环境、调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的重要机制,具有重大的生物学意义。

RNAi现已成为国内外研究的热点,不久前被《Science》评为2002年最重大科技突破。随着对RNAi机制研究的深入和RNAi技术的不断完善,RNAi有望成为治疗病毒感染性疾病的新方法。

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存在的问题
  • 目前siRNA导入胞内的效率低下,如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍;
  • 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA 的模板,从目前的研究来看,序列的选择原则尚不清楚;
  • 目前RNAi 机制尚未完全阐明,尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。
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THANK YOU!

03年金秋于华西坝