El diagnóstico de tuberculosis utilizando técnicas de biología molecular

1. El diagnóstico de tuberculosis utilizando técnicas de biología molecular Beatriz LópezServicio MicobacteriasInstituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Carlos G. Malbran”

2. Estudia las macromoléculas (ADN, ARN, enzimas, hormonas) Linus Carl Pauling (1930) Watson y Crick(1953) Frederic Sangery Walter Gilbert(1977) Kary Mullis(1986)

3. Aportes al manejo de las enfermedades infecciosas Secuencias especie-específicas • Detección de un gérmen patógeno en la muestra o en cultivo Secuencias y elementos móviles que generan variabilidad • Detección de aislamientos idénticos • Detección de resistencia a drogas Mutaciones • Prevención • Tratamiento Genes

4. Cuales son aplicaciones útiles y factibles para el manejo de la tuberculosis

5. Dependiendo del escenario donde se trabaja Situación epidemiológica de tuberculosis Población a investigar Infraestructura (edilicia, bioseguridad) Logística (transporte y telecomunicación) Recursos (humanos y presupuesto)

6. Uruguay 2011 Prevalencia baja 21 /100000 hab Actividades recomendadas -Diagnóstico de situación -Incorporación de métodos para incrementar la confirmación del diagnóstico de tuberculosis -Incorporación de métodos para el diagnóstico de TB latente -Incorporación de métodos para optimizar la vigilancia epidemiológica

7. 2011 817 casos 94% casos pulmonares (57% B+) 13% HIV + Examen microscópico en el día Diagnóstico de TBC Sensibilidad limitada a 5000 a 10000 bacilos /ml

8. Evidencia sólo 10 a 100 BAAR presentes en una muestra Cultivo Económicos caros Lentos rápidos Disminuir a la mitad el tiempo de detección del cultivo positivo (7 a 30 días para líquidos y 15–60 días para sólidos)

9. Amplified M. tuberculosis Direct Test (AMTD) BD-ProbeTec (SDA) test Roche COBAS Amplicor MTB Abbott LCx test Neested PCR PCR 1986 2000 1 ciclo 2 ciclos 3 ciclos mitad de ciclos último ciclo Amplificación de ácidos nucleicos Amplificación

10. Amplified M. tuberculosis Direct Test (AMTD) BD-ProbeTec (SDA) test Roche COBAS Amplicor MTB Abbott LCx test Real time PCR Neested PCR PCR 1986 2001 Amplificación de ácidos nucleicos

11. Meta-análisis en muestras respiratorias (125 estudios utilizando equipos comerciales) El uso de diferentes puntos de corte y de otras muestras que no son esputo podrían explicar la heterogeneidad de resultados Basados en estas observaciones, el uso de los métodos de amplificación no pueden reemplazar a los métodos convencionales para el diagnóstico de TBC pulmonar Ling DI, et al PLoS ONE 3: e1536, 2008

12. Valoración del método de amplificación de ácidos nucleicos en una zona urbana de moderada prevalencia entre 2000 -2004 Sensibilidad: 92,5% (1337/1445) Especificidad: 97,3% (940/966) Laraque F.et al. Clin Infect Dis 49:46, 2009

13. Valoración del método de amplificación de ácidos nucleicos en una zona urbana de moderada prevalencia entre 2000 -2004 Sensibilidad: 92,5% (1337/1445) 94,3%(1262/1339) 70,7%(75/106) Los resultados están en línea con la bibliografía y con las nuevas recomendaciones del CDC y apoyan el uso de las pruebas de amplificación para un mejor manejo del paciente Laraque F.et al. Clin Infect Dis 49:46, 2009

14. Meta-análisis en muestras no respiratorias Muestras de liquido cefalorraquídeo (50 estudios) 56 (46-66) 98(97-99) No determinada Pai M, et al. Lancet Infect Dis 3:633, 2003

15. Meta-análisis en muestras no respiratorias Muestras de liquido pleural (40 estudios) n:1996 muestras Pai M.,et al BMC Infectious Diseases 4:6, 2004

16. Recomendaciones del uso de métodos de amplificación CDC. MMWR 58(01);7-102009 Interpretar resultados de AAN correlacionando con el resultado de la baciloscopia Muestras respiratorias B+ AAN + se presume TBC Muestras respiratorias B- • Pacientes • vírgenes de tratamiento • con imagen de patología pulmonar • para quienes no se ha decidido instaurar tratamiento anti-TBC Si resulta positiva en una muestra respiratoria con baciloscopia negativa, el resultado debe ser confirmado con otra PCR realizada otro día, con otra muestra del paciente, para descartar contaminación de laboratorio El resultado negativo no descarta tuberculosis

17. Los organismos de regulación de países industrializados aun no han aprobado la aplicación de equipos diagnósticos que amplifican ácidos nucleicos para investigar tuberculosis extrapulmonar

18. Amplificación de ácidos nucleicos Amplified M. tuberculosis Direct Test (AMTD) Roche COBAS Amplicor MTB BD-ProbeTec (SDA) test Cepheid Xpert MTB test Abbott LCx test Real time PCR TRCRapid M.TB PCR Neested PCR LAMP 1986 2006 2009 2001

19. 6 cebadores FIT cebador interno de avance BIP cebador interno reverso F3 y B3 cebadores externos FLP BLP cebadores de lazo Bst polymerase fragment Buffers de mezcla dntps 63 ºC 60 minutos En papel de aluminio SYBR Green I (Invitrogen) Centrifuga después de la reacción LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) calcein, manganese chloride,Hydroxy naphthol blue Ming Hong, et al. World J Microbiol Biotechnol (2012) 28:523–531

20. http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html

21. Mitarai S, et al, 2011 CMT SP,SC LAMP test Kit Bst 67ªC Real -Time turbidimetry and fluorencense 40 min Geojith G, et al, 2011 MT,MB SP rimM Bst 65ªC SYBR Geen I 120 min Khushboo J, et al, 2011 CMT CSF IS6110 Bst 63ªC Real -Time turbidimetry 60 min Aixiao Bi, et al., 2012 MT,MB,MA,MM SC hspX Bst 67ªC Real -Time turbidimetry 27 min 10 copies Ming Hong, et al, 2012 MT,MB SP,SC Esat6/ mtp40 Bst 67ªC Calein, MnCl2, hydroxy naphthol blue, SYBR Green I 45 min 25 copies MT: M. tuberculosis; MB: M. bovis; MA: M. africanum; MM: M. microti; CMT:Complejo M tuberculosis, ; SP: sputum; SC: solid culture; CSF: cerebrospinal fluid

22. Evaluación del equipo LAMP para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar

23. Sensibilidad 84% Especificidad 96% Prevalencia 5% LAMP VPP : 42 / 83 *100 : 50% VPN : 912 / 920 *100 : 99,1%

24. Evaluación del método LAMP para el diagnóstico de meningitis tuberculosa Khushboo J. Nagdev, et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2011, p. 1861–1865

25. Ventajas • Rápida amplificación de DNA utilizando condiciones isotérmicas • No requiere equipamiento • Simple, sencillo • Alta sensibilidad en menor tiempo por el uso de cebadores de lazo • Sistema cerrado que reduce el riesgo de contaminación por amplicones pero…. Todavía debe ser mejorado el sistema para mejorar la especificidad Evaluado en otros escenarios

26. PCR en tiempo real integrado en un casette cerrado Xpert MTB/RIF (Cepheid Sunnyvale, CA) Cepheid Xpert MTB test 1-Licuefacción e inactivación del esputo 4- Filtración y lavado automático de la muestra 5- Lisis por ultrasonido y extracción del DNA 6- Mezcla de DNA con reactivos de PCR desecados 7- PCR hemi-nested con cuantificación fluorescente (PCR tiempo real) 2- Carga de 2 ml de muestra en el cartucho 3- Introducciòn del cartucho dentro del aparato

27. PCR en tiempo real integrado en un casette cerrado Xpert MTB/RIF (Cepheid Sunnyvale, CA) http://www.jove.com/video/3547/diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test Único proceso manual Muestra decontaminada Con solución NaOH- y isopropanol 15 minutos Disminuye en 6-8 logs la viabilidad

28. Cámaras con soluciones y reactivos liofilizados siringe Válvula rotatoria y reactivos para purificación de ADN o ARN Tubo de PCR Émbolo( jeringa) Raja et al.: Clinical Testing. Clinical Chemistry 51, 5, 2005

29. 95% de cepas resistentes a R tienen mutaciones en esta región PCR semi-anidada

30. TRATAMIENTO ESTANDARIZADO DE TUBERCULOSIS La resistencia a estas drogas define la multiresistencia meses 2HRZ+E ó S 4HR DROGAS DE PRIMERA LÍNEA isoniacida rifampicina pirazinamida etambutol estreptomicina

31. MORTALIDAD FRACASO MULTIRRESISTENCIA 3,7 15,4 OTRAS RESISTENCIAS • Cualquiera 1,0 3,3 • Cualquiera que incluya R 0,7 5,5 • A una droga Rifampicina 0,5 5,5 Isoniacida 1,5 2,2 Estreptomicina 1,3 2,3 Etambutol 2,1 0 RESULTADO DEL TRATAMIENTO DE TUBERCULOSIS Corea, Perú, Hong Kong, Ivanovo, República Dominicana, Italia n=5526 casos nuevos RIESGO RELATIVO (Mantel-Haenszel) DE Espinal MA et al. JAMA 283: 2537-45. 2000

32. 95% de cepas resistentes a R tienen mutaciones en esta región Bacilos sin mutaciones PCR semi-anidada

33. 2 horas la hibridación emite señal fluorescente captada y evidenciada automáticamente y en tiempo real mediante un sensor y un software que dibuja en una curva la señal cuantificada mostrando el progreso de la reacción

34. M tuberculosis resistente a R al menos una sonda de rpoB no hibrida o si la hibridación entre la 1ª y última de las 5 sondas tiene retraso (hay mutaciones que impiden la hibridación, otras la retardan )

35. Sistema de PCR en tiempo real cerrado • Ventajasoperativas • Primera vez que un test con mayor sensibilidad que la baciloscopía • puede ser aplicado y descentralizado con mayor facilidad que el cultivo • no es necesario juntar muestras para mejorar la operatividad o bajar costos genera riesgo biológico similar al generado por la baciloscopía minimiza el tiempo de procesamiento y el riesgo de contaminación cruzada de laboratorio Emplea iguales principios que sistemas comerciales anteriores, pero en un contenedor cerrado y con proceso automatizado

36. Evaluación del sistema Xpert /MTB Rif para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en adultos n % (IC 95%) 1770/1811 97,7 Sensibilidad BK+ (97,1-98,4) 72,9 BK-C+ 759/1041 (70,2-75,6) 99,2 Especificidad 10740/10823 (99,1-99,4) 13675 Kim SY, et alInt. J Tuberc Lung Dis 2012 ,11:1471-6 Dorman SE, et al. PLoS ONE 2012 ,7:e 43307 Corea del Sur Sudafrica 17 publicaciones, 17 países 1 muestra / paciente

37. Evaluación del sistema GeneXpert con muestras pulmonares Investigando 2 y 3 muestras la sensibilidad entre casos BK se incrementa a 85% y 90% La especificidad no está afectada por la presencia de micobacterias ambientales en las muestras

38. Evaluación del sistema Xpert MTB Rif para el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar

39. Evaluación del sistema Xpert /MTB Rif para detectar la resistencia a rifampicina

40. Xpert MTB/RIF plataforma multiple. Otras aplicaciones Xpert SA Nasal                                            Staphilococcus aureus meticilino resistente Xpert EV                                             Enterovirus (meningitis) Xpert C. difficile Detection of Clostridium difficile Xpert vanA                                   Enterococcus vancomicina resistente Clostridium difficile Flu A, Flu B, and 2009 H1N1 Marcadores oncológicos Se espera prueba para HIV en diciembre 2013

41. Costo Xpert/MTB Rif • Para que sea viable y sostenible • se debecalcular no sólo el costo de los equipos y cartuchos • sinotambien de • Fuentes suplementarias de energia (donde los cortes son frecuentes) • Acondicionamiento de la temperatura (siesmuyalta) • La gestión de calidad • entrenamiento, validación en el país, evaluacionesexternasperiodicas • (no sustituiblepor la experienciainternacionalnipor la disponibilidad de controlesinternos) • Manejo y mantenimiento de stock en buenascondiciones • Calibracion y mantenimiento • Desecho de grandesvolumenes de insumosplásticos(cartuchos)

42. Recomendaciones de utilización del Xpert-MTB/Rif® en condiciones de programa en Latinoamérica http://new.paho.org/hq/dmdocuments/2011/Implantacion_Xpert-MTB-Rif_AMRO_Guatemala.pdf

43. Consenso Laboratorios Supranacionales, Centros Colaboradores de OMS y Laboratorios de Referencia Nacional de países priorizados de las Américas para la aplicación costo-efectiva del sistema GenXpert MTB/RIF El sistema debería ser empleado como primera prueba de diagnóstico en los siguientes dos grupos de pacientes SR o caso con TB pulmonar con alto riesgo de TB-MDR (todo previamente tratado, contactos de MDR, positivos al 2do mes y otros grupos de riesgo reconocidos por el país) SR VIH positivos Complementada con baciloscopia y cultivo

44. La baciloscopia permite monitorear el tratamiento rápida y económicamente • El cultivo sigue siendo necesario para • confirmar el diagnóstico de 30% adicional de casos BK- • detectar resistencia a R originada por mutaciones no investigadas por los sistemas moleculares comerciales y validar resultados dudosos • investigar sensibilidad a otras drogas de primera y segunda línea

45. Los métodos moleculares aplicados al diagnóstico rápido de tuberculosis no reemplazan a la baciloscopia para detectar casos avanzados en escenarios con alta prevalencia y limitados recursos porque son mas caros no reemplazan al cultivo para la detección de casos poco avanzados o formas extrapulmonares porque son menos sensibles parecen ser muy precisos para el diagnóstico de tuberculosis y detección de resistencia a rifampicina

46. Muchas gracias