Электронно-микроскопический метод:

1. ЛЕКЦИЯ 3ГЕНОМ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ1.Организация молекул митохондриальной ДНК растений разных систематических групп 2.Изменчивость структуры молекул митохондриальной ДНК3.Митохондриальные плазмиды 4.Гены митохондрий 5.Интроны митохондриальных генов. Гены интронов 6.Ядерные и пластидные ДНК-последовательности в митохондриальном геноме растений7.Репликация митохондриального генома растений

2. Обнаружение митохондриальной ДНК в клетках • Электронно-микроскопический метод: нити, дающие окрашивание с ДНК-красителями которые разрушались нуклеазами, увидеть в митохондриях удалось в начале 60-х годов Оказалось, чтомтДНК основных систематических групп эукариот: простейших, растений, грибов животных значительно отличаются друг от другапо структуре

3. Параметры мтДНК растений • Мт ДНК высших растений – менее 1% от всей ДНК клетки, очень редко достигает 10-15% (гипокотиль дыни). • Плавучая плотность ДНК мт растений колеблется незначительно: 1,705-1,707, что соответствует 48% ГЦ-пар. • Размеры мт геномов колеблются очень сильно: 180-2500 тпн. В семействе тыквенных (Сucurbitaceae) 330 тпн2500 тпн дыня арбуз

4. Виды молекул митохондриальной ДНК: • большие «геномные» кольца (крайне редко) • система меньших колец разных длин • линейные молекулы • катенированные кольца • розеткообразные молекулы: до 50 петель с одним ДНК центром (подобие нуклеоидов пластид)

5. 10 сигма-подобных структур мтДНК Chenopodium album Стрелки указывают места соединения кольца и хвоста (a) кольцо3 kb, хвост 28 kb; (b) кольцо 4.4 kb, хвост 9 kb; (c) кольцо 6.5 kb, хвост 0.2 kb; (d) кольцо 7.4 kb, хвост 6.2 kb; (e) кольцо 8.9 kb, хвост 0.5 kb; (f) кольцо 11.6 kb, хвост 7.9 kb; (g) кольцо 20 kb, хвост 65.5 kb; (h) кольцо 51 kb, хвост 26.9 kb; (i) кольцо 61.1 kb, хвост 6.1 kb; (j) кольцо 128 kb, хвост 36.5 kb.

6. Сигма-подобные структуры мтДНК Chenopodium album х10

7. Размерные классы, обнаруженные при анализе 8,000 молекул мтДНКChenopodiumalbum Проанализирована291 сигма-подобная молекула

8. Большие рекомбинационные повторы- особенность митохондриальной ДНК растений Модель структурымитохондриального генома Brassica campestris 218 kb 83 kb 135 kb два малых кольца – результат рекомбинации по двум повторам основного кольца полный геном– большое кольцо

9.    Recombination in mtDNA of Arabidopsis thaliana. The mtDNA contains a direct repeat (I) and an inverse repeat (II).

10. Рекомбинационные повторы обнаружены почти во всех изученных митохондриальных геномах У пшеницы их 10 (!), у кукурузы - 5 прямых и 1 инвертированный При таком количестве повторов число субгеномных колец может быть огромным.

11. Рекомбинация молекул мтДНК пшеницы [A]: образование изомера –рекомбинация по инвертированному повтору ( IR ) copy-1 и соpy -2. [B] и [C]: образование двух комплементарных субгеномных молекул при рекомбинации по прямому повтору ( DR ) Copy-2 и -3, and и две копии R5 [D]: образование аберрантной молекулы MC, имеющей лишнюю копию кластера Copy-3/2 и R5 повтора при рекомбинации по повтору R6 C B A D

12. Не все повторяющиеся последовательности способны рекомбинировать Собственных ферментов-рекомбиназ эти последовательности не кодируют ??? Чем отличаются рекомбинирующие повторы от нерекомбинирующих, неясно

13. Размеры больших повторов Для большинства повторов: – от 1000 пн до 10000пн. Наименьший из известных больших повторов - 266 пн. Необычно большие повторы: – у ЦМС- формы петунии 252 000 пн - у F- ревертанта ЦМС-Т кукурузы 165 000пн.

14. Малые повторы в митохондриальных ДНК растений • Размер – от 6-7 до нескольких сот нуклеотидов ??? Происхождение малых повторов неясно Малые повторы участвуют в редких рекомбинациях, что иногда приводит к образованию больших повторов Показано, что при изменении внешних условий и при культивировании в пробирке, митохондрии могут дестабилизироваться, часть генома при этом утрачивается или преобразуется, что может иметь адаптационный смысл

15. R1 С Модель образования большого повтора с помощью малых повторов в мтДНК растений А R1 R2 R1 I R2 Исходная основная кольцевая молекула В R2 R1 R1 R2 R1, R2 – малые повторы III большие повторы II R2 Новая молекула с большим рекомб. повтором и большой делецией R1 R1 D R2 R2 R2

16. Модель рекомбинации мтДНК табака Две субгеномные молекулы, C и D, образуются в результате рекомбинации по повторам (в черных участках P кольца). SacI фрагменты: P: 19- и 5.4-kb rec1 C и D: 11.8- и 12.6-kb. Светло-серые фрагменты – 3 повторяющиеся последовательности CMSII мт геном содержит только C молекулы

17. Митохондриальные плазмиды – малые линейные и кольцевые ДНК- и РНК- молекулы, не гомологичные геномной мтДНК. . Размер мт плазмид колеблется от 1000 до 30000пн. Митохондриальная плазмида mp1 of Chenopodium album – разные структурные модификации

18. Электронные фото различных молекул митохондриальных плазмид ( mp1 )Chenopodium album (a - g) Типичные сигма-подобные структуры mp1. (a) Двунитчатый кольцевой мономер (1.3 kb) с однонитевым хвостом (170 пн); (b) Двунитчатый кольцевой мономер с однонитевым хвостом 400 п.о.; (c - g) двунитчатые кольца 1.3 kb с двунитевым хвостом длиной 0.1 kb (c), 0.6 kb (d), 0.9 kb (e), 1.2 kb (f), and 3.4 kb (g).

19. Плазмиды в митохондриях найдены у многих культурных растений – кукурузы, сорго, бобов и др. плазмиды, скорее всего, произошли из других клеточных геномов и, возможно, из других организмов ???

20. Три основные категории плазмидв митохондриях растений: кольцевые ДНК-плазмиды линейные ДНК- плазмиды, РНК-плазмиды. свекла сорго рис ДНК фасоль кукуруза подсолнечник Плазмид у одного вида может быть несколько типов – у риса их четыре Плазмиды могут утрачиваться без каких-то видимых последствий для растений

21. Кольцевые плазмидоподобные молекулы в митохондриальном геноме риса

22. Линейные ДНК-плазмиды – уникальная группа репликонов Имеют высокий процентАТ-пар и терминальные инвертированные повторы У кукурузы – два типа линейных плазмид (S, R) Линейные плазмиды способны интегрироваться в митохондриальный геном ! Некоторые последовательности линейных плазмид гомологичны вирусным РНК-полимеразам.

23. РНК-плазмиды - наименее изученная группа Обнаружены у риса, кукурузы, Brassica, сахарной свеклы. Самые крупные (18 тпн) Четыре типа РНК-плазмид найдено у кукурузы – два типа двунитчатых и два типа однонитчатых. Репликация РНК-плазмид не подавлялась актиномицином Д, что указывает на участие в процессе РНК-полимеразы вирусного типа ??? Происхождение РНК-плазмид неясно. Возможно, они являются реликтами прошлых инфекций, в результате чего сохранился геном патогена

24. Размерысеквенированных митохондриальных геномоврастений • Marchantia polymorpha 186609 п.н.66 генов (94 ORF) • Beta vulgaris368801 «» 59 генов • Arabidopsis thaliana 366924 «» 57 генов • Oryza sativa 490520 «» • Brassica napus 221 853 «» 54 гена • Zea mays 569630 «» 58 генов (121 ORF) • Triticum aestivum 452528 «» 55 генов • Nicotiana tabacum430597«»60 генов Самые большие ДНК молекулы - не самые генетически насыщенные

25. Митохондриальные геномы низших растений имеют меньшие размеры, чем у покрытосеменных 105340 п.нмох Physcomitrella patens 67737 п.н.харовые водоросли Chara vulgaris 42424 п.н пресноводные жгутиковые Mesostigma viride Streptophyta Chlorophyta Все зеленые растения принадлежат к одной из двух ветвей: Streptophyta (наземные растения и харовые водоросли)и Chlorophyta (зеленые водоросли) С выходом растений на сушу произошло увеличение размера митохондриальных геномов, в основном за счет межгенных участков

26. 0.4% 49% 1.3% 16.1% ОРС >100 п.н. не установлена функция тРНК рРНК 10.2% белок-кодирующие гены рекомбинационные повторы 2.9% 2.2% ядерно-мт гомологичн последоват. 4% Интроны 1.2% 3.9% ядерная ДНК пластидная ДНК 9% другие повторы Митохондриальный геном Arabidopsis Неустановленные последовательности не имеют явного сходства ни с одной идентифицированной последовательностью в базах данных. Интроны - исключительно группы II. Гены митохондрий составляют меньшую часть мтДНК молекулы, они консервативны между родственными видами

28. Митохондриальная ДНК рапса Большая часть генома изменчива, не кодирует белков и часто уникальна для определенного вида растений

29. К началу 2009 года в базе GOBASE http://megasun.bch.umontreal.ca/ogmp/projects/other/mtcomp.html представлены полные сиквенсы 13-ти митохондриальных геномов высших растений, относящихся к 8 видам Всего полных сиквенсов органельных ДНК на начало 2009 года - 1898 Общее число видов, для которых эти сиквенсы получены - 1283

30. Классификация последовательностей мтДНК пшеницы Практически все уникальные последовательности мтДНК пшеницы относятся к некодирующим областям

31. 78S (60S +44S) 70S (50S +30S) Рибосомы митохондрий крупнее рибосом пластид: Рибосомальные РНК гены:26S,18S и 5S, у кукурузы еще 4,5S. 18-5Sсцеплены в один кластер и удалены от 26S. Ген 5sу грибов и животных в митохондриальном геноме отсутствует

32. Набор тРНК, кодируемых митохондриальным геномом, значительно различается у разных видов растений Около трети митохондриально кодируемых тРНК генов в действительности произошли из хлоропластных генов, интегрированных в митохондриальный геном. н.о.= не определялось. ??? Каков механизм импорта тРНК молекул через мембрану? Почему одни молекулы проходят, другие нет? Кто выполняет роль переносчиков?

33. Генов рибосомальных белков в митохондриальной ДНК намного меньше, чем в хлоропластной В мтДНК маршанции их 16, у арабидопсиса – 8. Гены субъединиц комплекса дыхат. цепи: и 25 у маршанции, 18 у арабидопсиса Выделенные жирным шрифтом гены найдены и у маршанции, и у арабидопсиса

34. В митохондриальном геноме арабидопсиса обнаружено более 150 ORF, состоящих из 100 и более пар нуклеотидов Часть из них – «обломки» генов, другая часть – гены, функция которых пока не установлена Псевдогены 2 типа: 1 Дегенерировавшие копии генов, не имеющие интактной копии в мт геноме – например ген ФЕН тРНК. 2 Дегенерировавшие копии генов, имеющие полноценные копии в мт геноме (химерные гены при ЦМС)

35. Интроны митохондриальных генов растений К 2000 году в мтДНК разных растений найдено 100 интронов Интроны составляют от 9% до 20% геномной последовательности мтДНК В мт ДНК арабидопсиса их 23 Длина их колеблется от 485 до 4000 пн Самый маленький интрон в митохондриальной ДНК – 389 пн.

36. Вторичная структура интрона coxIIу пшеницы Интроны группы II осуществляют самосплайсинг (рибозимы) они вероятно могут выполнять роль мобильных генетических элементов

37. Новые интроны появляются скорее всего дупликацией существующих и их внедрением в новые участки генома Поэтому столь велико сходство между интронами в разных генах Некоторым интронам более 400млн лет! Они сформировались еще до разделения растений на высшие и низшие 25% всех интронов содержит ОRF ( ген mat-r) Он отличается неканоническим инициирующим кодоном – GGG. Функция матураз - вырезание интрона из пре-мРНК.

38. Ядерные и пластидные последовательности в митохондриальном геноме У арабидопсиса 15 тпн (5% от всего генома мт) - ядерные Большая часть этих последовательностей – мобильные генетические элементы, в основном ретротранспозоны. Также имеются последовательности, сходные с транспозонами бактерий и животных (межвидовой перенос генетических элементов??? ). Мало данных, так нет полных сиквенсов ядерных геномов растений. Арабидопсис: 1,2% мтДНК– пластидные последовательности Пшеница – 3% мтДНК -пластидные последовательности У кукурузы в мтДНК интегрирован фрагмент пластидной ДНК размером 12тпн. В митохондриях растений функционируют перенесенные из пластид гены тРНК

39. Вирусные последовательности в митохондриальном геноме арабидопсис – две ORF весьма похожи на РНК-зависимые РНК-полимеразы, типичные для РНК- вирусов. Особенно они похожи на РНК полимеразы грибов, патогенных для растений. По-видимому, именно таков был путь переноса: вирусыгрибырастения –хозяева. Механизм интеграции: ??? Cкорее всего, через обратную транскрипцию образуется ДНК-копия

40. Итак, митохондриальный геном растений: • содержит 50-60 генов • крайне изменчив по структуре, • белок-кодирующие гены и РНК гены составляют менее 20% • имеет много не идентифицированных ORF • функция половины мтДНК молекулы не выяснена • необычно большие молекулы мтДНК за счет интронов, повторяющихся последовательностей, ядерных, пластидных и вирусных фрагментов • некодирующие участки достигают длины 57 тпн. • гены, обеспечивающие транскрипцию, процессинг и трансляцию мт генома, локализованы в ядре ОРС >100 п.н. 9%