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  1. Laboratorio No. 12 Biología molecular Instructora Andrea Arias Garcia Biología 3051 L Laboratorio 12 Biología molecular Andrea Arias Garcia

  2. El núcleo es un organelo característico de las células eucariotas. El material genético de la célula se encuentra dentro del núcleo en forma de cromatina El Núcleo

  3. Un cromosoma es una molécula muy larga de ADN que contiene una serie de genes. Un cromosoma está formado por doscromátidas. En cada una de ellas hay un filamento de ADN replegado idéntico en ambas cromátidas. Cromatina y cromosoma

  4. La molécula de ADN está constituída por dos largas cadenas de nucleótidosunidas entre sí formando una doble hélice. El ADN

  5. Los nucleótidos Un nucleótido es una molécula compuesta por : • Una pentosa • ribosa • desoxirribosa • Ácido fosfórico • Una base nitrogenada, que puede ser : • adenina • guanina • citosina • timina • uracilo

  6. Partes de un nucleótido

  7. La estructura del ADN está definida por la "secuencia" de las bases nitrogenadas. Este orden constituye las instrucciones del programa genético de los organismos. Estructura del ADN

  8. La unión de las bases se realiza mediante puentes de hidrógeno Este apareamiento está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). Las bases nitrogenadas

  9. MÓdelo del ADN Watson y Crick (1953)

  10. Biología molecular • La biología molecular es una herramienta para estudiar las relaciones evolutivas entre los organismos. • Estudia el ADN y los genes que contiene. • Todas las células contienen ADN que caracteriza a los organismos vivos. Por cambios y mutaciones en el ADN tenemos organismos compuestos por pocos cientos de bases hasta organismos mas complejos.

  11. Enzimas de restricción y electroforesis de ADN

  12. Enzimas de restricción • También conocidas como endonucleasas. Son extraídas de organismos procariotas (bacterias) donde actúan como un mecanismo de defensa para degradar ADN exógeno. • Su nombre esta dado según el genero y la especie de la bacteria de donde se aisló. Ej: Eco RI E genero Escherichia co especie coli R cepa RV 13 I primera endonucleasa aislada

  13. Enzimas de restricción • Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen. • Permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)

  14. Enzimas de restricción • Al cortar el ADN las enzimas de restricción pueden producir dos tipos de cortes: cohesivos y abruptos. • Abruptos: cortan las hebras ADN en la misma posición AATATT TTATAA • Cohesivos: cortan la doble hebra de ADN de manera escalonada.

  15. Factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción • Pureza del ADN: la presencia de contaminantes como proteínas, cloroformo, etanol etc. inhiben la endonucleasa. • Temperatura y pH: pueden afectar la estabilidad y la actividad de las endonucleasas. • Amortiguador (buffer) adecuado: este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones optimas.

  16. Electroforesis • La electroforesis es un método que permite el desplazamiento de una molécula dentro de un campo eléctrico. La molécula con carga se mueve en dirección al electrodo con signo opuesto. • En la electroforesis se aplica un campo eléctrico a lo largo de un soporte físico, generalmente geles de agar, agarosa, almidón, acrilamida, también se pueden usar otros soportes como las tiras de acetato de celulosa. • Las moléculas que posean una carga neta (proteínas y ácidos nucleicos) se moverán dentro del campo eléctrico, separándose a medida que pasa el tiempo.

  17. Cámara de electroforesis

  18. La agarosa • La agarosa es un polisacárido de galactosa (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición más homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0,5 a 2%)  poseen la propiedad de permanecer líquidas por encima de aprox. 50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse. • Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimericas, embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas de ácido nucleico a su través, en mayor medida cuanto más grandes sean éstas.

  19. Preparación del gel

  20. Factores que inciden en la electroforesis • La carga eléctrica de las moléculas • El pH del medio. • El tamaño de las moléculas: Las moléculas de DNA y RNA son en general demasiado grandes para que avancen a una velocidad razonable por los geles, por lo que lo habitual es fragmentarlas antes de someterlas a electroforesis.

  21. Al preparar el gel enfriando la agarosa en un molde adecuado, se dejan en él unos huecos o pocillos para poder introducir luego en ellos la muestra, y que así ésta se vea obligada a introducirse en el seno del gel cuando apliquemos el campo eléctrico Para servir la muestra

  22. Procedimiento Para preparar TBE 1X: • Si se usa TBE 20X, para preparar 100 ml: echar en probeta 5 ml de TBE 20X y echar agua destilada hasta llegar a 100 ml. • Si se usa TBE 10X: 10 ml de TBE 10X y echar agua destilada hasta llegar a 100 ml.

  23. Procedimiento Elaboración de agarosa: • 2 microtubos (1 gramo) de agarosa más 100 ml de TBE 1X • Mezclar en erlenmeyer LIMPIO y poner en hot plate USAR GUANTE DE CALOR y agitar girando la mezcla hasta que hierva y se vean las burbujas en la superficie. • Saque de hot plate y deje enfriar(50C) • Vertir en bandeja empezando en una esquina • Coloque la peinilla • Deje que solidifique.

  24. Activación del DNA • El DNA se prepara añadiendo 100 microlitros de agua destilada y dejando a temp ambiente por 5 minutos y agitar luego. Colocar en hielo o nevera luego mientras se usa. + 100 uL de Agua destilada Incubar por 5 min. a temperara ambiente DNA

  25. Utilización de Enzimas de restricción • 2 microlitros de DNA y 18 de agua destilada (con la punta de micropipeta, agitar) y colocar a 37° C por 20-30 minutos. LA TEMPERATURA ES CRITICA, no dejen que suba!!! Luego ponga tubos en hielo mientras se preparan muestras. + 2 uL de DNA +18 de agua destilada Incubar por 30 min. a 37° C y luego colocar en Hielo Tubo pqñ Con enz.

  26. DNA sin cortar: 2 microlitros de DNA 8 de agua destilada 2 de loading dye Para DNA cortado (restricciones): 10 microlitros de digestión 2 de loading dye Para preparar muestras para corrida

  27. Para correr gel • Coloque un papel blanco debajo de la cámara • Ponga bandeja en la cámara, de manera que las fosas queden en el lado negativo (negro), • Asegúrese de que el buffer cubra el gel • Quite CON CUIDADO la peinilla. • Añada muestras a las fosas. NO MUEVA CAMARA!!!! • Ponga tapa y prenda voltímetro. Se correra a 80 voltios • Deje que corra el gel hasta llegar aprox. a media pulgada del extremo positivo.

  28. Teñir • Poner el gel en bandeja y cubrir con tinte. • Dejar por media hora, agitar de vez en cuando. • Sacar gel (usen guantes!!!) y poner en agua a lavar hasta que destiña bastante. Ver en iluminador.

  29. Fotografía electroforesis de ADN ADN + enzimas de restricción Fragmentos de ADN Marcador