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肖少波 华中农业大学动物病毒室

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗研究. 肖少波 华中农业大学动物病毒室. 猪繁殖与呼吸综合征. 猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS) ，又称 兰耳病 1987 年 首次暴发于美国北卡罗纳州 ——“ 神秘病 ”，导致至少 100 万头猪死亡 1991 年， PRRS 席卷欧洲大陆 1996 年， PRRS 在我国首次爆发；同年，丹麦再次暴发 PRRS ，全国 40-50% 的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡 2000 年，美国再次大爆发 PRRS ，并将其列为当前最严重的猪病毒性传染病 目前， PRRS 遍及世界养猪国，并呈流行态势. 猪繁殖与呼吸综合征的危害.

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  1. 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗研究 肖少波 华中农业大学动物病毒室

  2. 猪繁殖与呼吸综合征 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称兰耳病 1987年首次暴发于美国北卡罗纳州——“神秘病”，导致至少100万头猪死亡 1991年，PRRS席卷欧洲大陆 1996年，PRRS在我国首次爆发；同年，丹麦再次暴发PRRS，全国40-50%的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡 2000年，美国再次大爆发PRRS，并将其列为当前最严重的猪病毒性传染病 目前，PRRS遍及世界养猪国，并呈流行态势

  3. 猪繁殖与呼吸综合征的危害 母猪—早产、流产、死胎、弱仔 公猪—精液品质下降 初生仔猪—高死亡率 其它年龄猪—呼吸系统疾病

  4. 蓝耳病流行新动向 • 近年来，病原致病力似有所增强，表现为怀孕母猪更加严重的流产和新生仔猪的高死亡率（Oleksiewicz, et al.)。 • 非典型性病原导致的“流产风暴”。 • 自1999年Rossow等在蓝耳病高发猪群中分离到嗜神经型蓝耳病病毒以来，目前越来越多的嗜神经型蓝耳病病毒被分离，提示蓝耳病病毒可能在扩大其靶组织或器官。

  5. 蓝耳病流行新动向 • 最近，欧洲型PRRSV在北美洲被多次分离到，表明该病的流行已不再局限于原来欧洲型只出现在欧洲的格局，预示欧洲型PRRSV可能正在向世界范围蔓延。

  6. 疾病 导致的直接经济损失 （折合成2004年） 蓝耳病（2004年） 5.6032亿美圆 猪瘟（根除计划启动前） 3.6409亿美圆 伪狂犬病（根除计划启动前） 0.3627亿美圆 蓝耳病流行新动向 • PRRSV导致的直接经济损失越来越大 • 根据美国农业部2005年统计的资料表明，2004年，蓝耳病导致的直接经济损失为5.6032亿美圆。（Neumann et al. J Am Vet Med Assoc. 2005 Aug 1;227(3):385-92)。

  7. 蓝耳病流行新动向 • 蓝耳病导致的间接危害越来越严重； • 蓝耳病病毒容易与伪狂犬病毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸道冠状病毒（PRCV)混合感染； • 严重干扰猪瘟的免疫效果—免疫抑制！ • 最近，还从所谓“无名高热”病料中分离到PRRSV。

  8. PRRS免疫预防现状—弱毒苗 • 能保护猪不出现临床症状，但不能阻止强毒感染。 • 只适合3-18周龄的猪和非孕母猪使用。 • 存在散毒问题和返强性，并且返强的几率相当高（可达30%)。

  9. PRRS免疫预防现状—弱毒苗 • 丹麦事件的教训：丹麦1996年7月使用美洲型PRRS弱毒疫苗免疫后，1996年底至1997年初出现了PRRS的多次大暴发，全国40-50%的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡。病毒分离与全基因组序列分析证实是由疫苗株引起的(Masden et al,1998;Botner et al,2000) • 与疫苗株同源性高达98%以上的强毒株越来越多 目前，许多国家已禁止使用弱毒苗。

  10. PRRS免疫预防现状—灭活苗 • 较弱毒苗安全，但产生的保护力不强，需要反复多次的免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。 • 疫苗安全性与有效性的矛盾以及目前尚无更好的疫苗使PRRS的免疫预防处于一种两难境况。 • 迫切需要更安全、高效、廉价的新型疫苗

  11. 0 10 15kb 5 Non-structural Structural 2a p(A) 1a 6 5¢cap 4 2b 1b 3 5 7 中和抗体相关性 GP5 \E(ORF5) GP2, GP3, or GP4 (ORF 2, 3, 4) 疫苗研究价值? M (ORF6) N (ORF7) ssRNA(+) AAA Lipid bilayer 蓝耳病病毒结构

  12. 新型疫苗研究现状 • 主要集中在具有诱导机体产生最强中和抗体能力的GP5蛋白 • 亚单位疫苗 • DNA疫苗 • 腺病毒载体疫苗 • 伪狂犬病毒载体疫苗 • 但所有以GP5为目的抗原的新型疫苗免疫猪后均未检测到PRRSV的中和抗体，不能完全阻止蓝耳病及病毒血症的发生

  13. GP5基因的修饰 在GP5基因N端的覆盖表位与中和表位间插入辅助序列 ，使中和表位充分展示 5’---FAVLVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELN---3’ 表位B（中和表位） 表位A（覆盖表位） 辅助序列

  14. P ORF5 pCI-52 CMV polyA P ORF5m pCI-52m CMV polyA 表达修饰的ORF5m基因的DNA疫苗 免疫小鼠，检测ELISA抗体、中和抗体和细胞免疫

  15. ELISA抗体（小鼠） • 以修饰的ORF5m基因构建的pCI-52M诱发特异性针对GP5蛋白的ELISA抗体显著高于未经修饰的pCI-52。

  16. 中和抗体（小鼠） • 以修饰的ORF5m基因构建的pCI-52M于首免小鼠后2周即产生可检测中和抗体（≥1：4），并且诱发的中和抗体水平显著高于未经修饰的pCI-52，最高达到1：32。

  17. 细胞免疫（小鼠） • 以灭活的PRRSV病毒为特异性刺激原，修饰的ORF5m基因构建的pCI-52M诱发细胞免疫水平显著高于未经修饰的pCI52

  18. 研究表明： 修饰型ORF5m基因具有更强的免疫原性，有希望成为新一代疫苗候选基因。 (Fang et al. Virus Genes, 2006,32:5-11)

  19. P ORF5 pCI-ORF5 CMV polyA P ORF6 pCI-ORF6 CMV polyA ORF6 P ORF5 P CMV pCI-ORF5/ORF6 CMV polyA polyA ORF5与ORF6基因共表达DNA疫苗

  20. 体外共表达的GP5和M蛋白形成异源二聚体 1 2 3 4 1 2 3 4 kDa 75.0 GP5-M (42kDa) 50.0 M-M (35kDa) 37.0 GP5 (25kDa) 25.0 M (19kDa) 20.0 15.0 1: pCI-ORF5/ORF6. 2: pCI-ORF6. 3: pCI-ORF5 4: pCI-neo. 50mM DTT + + + + - - - - A B Western blot检测 变性条件(A)和非变形条件(B)

  21. ORF5/ORF6双基因共表达对GP5和M蛋白的亚细胞定位的影响ORF5/ORF6双基因共表达对GP5和M蛋白的亚细胞定位的影响 m4EGFP P ORF5 pCI-5m4EGFP CMV polyA RFP RFP P ORF6 pCI-6RFP CMV polyA RFP ORF6 P ORF5 m4EGFP P CMV pCI-5GFP6RFP CMV polyA polyA

  22. A B C D GP5 (mut4EGFP) M (DsRed2) (A) pCI-5GFP (B) pCI-6RFP (C) pCI-5GFP/6RFP (D) pCI-5GFP/6RFP • GP5蛋白单独表达时主要定位在细胞核周围的内质网，而与M蛋白共表达形成异源二聚体时定位模式发生改变，主要定位在高尔基体。

  23. 30 2 weeks after primaryvaccination 4 weeks after primary vaccination 25 6 weeks after primaryvaccination 20 15 Neutralizing antibody 10 5 0 pCI-ORF5 pCI-ORF6 pCI-neo pCI-ORF5/ORF6 pCI-ORF5+pCI-ORF6 Groups ORF5/ORF6双基因共表达显著增强中和抗体 • GP5和M蛋白共表达较单独表达所产生的中和抗体显著增强，最高达1：32。

  24. ORF5/ORF6双基因共表达显著增强细胞免疫 • GP5和M蛋白共表达较单独表达所产生的细胞免疫应答显著增强，同时联合免疫也表现出一定程度的提高。

  25. 研究表明： 1. 体外表达的GP5蛋白可以与M蛋白通过二硫健形成异源二聚体，并且这种二聚体的形成有利于GP5蛋白从内质网向高尔基体的转运，有利于免疫提呈的增强，提高免疫应答。 2. GP5-M异源二聚体形成的几率和多少与免疫反应的强弱具有正相关性。 • GP5和M蛋白共表达为新型疫苗的研究提供了新的思路。 Jiang et al, 2006, Vaccine, 24(15):2869-2879

  26. ORF6 P P ORF5 CMV pCI-ORF5/ORF6 CMV polyA polyA ORF5m与ORF6基因共表达DNA疫苗 ORF6 P P ORF5m CMV pCI-ORF5m/ORF6 CMV polyA polyA

  27. ORF5m与ORF6基因共表达增强中和抗体

  28. ORF5m与ORF6基因共表达增强细胞免疫

  29. PRRSV新一代疫苗设计 • 具有更好免疫原性的ORF5m基因为候选基因； • 采取GP5m和M蛋白共表达策略； • 以PRV基因缺失标志疫苗株表达系统，构建PRV-PRRSV二价基因工程疫苗。

  30. 通用转移载体pgG-Uni 重组中间转移质粒 TK-/gG-/LacZ+ PCR筛选 IBRS-2 细胞 Southern blot 空斑纯化 检测 Western blot PRV-PRRSV重组病毒构建流程图

  31. 构建的rPRV-PRRSV重组病毒： • RV5: TK-/gE-/GP5+ • RV56: TK-/gE-/GP5+/M+ • RV5m：TK-/gE-/GP5m+ • RV5m6:TK-/gE-/GP5m+/M+

  32. 重组病毒免疫小鼠后的PRV中和抗体

  33. 重组病毒免疫小鼠对PRV的免疫保护

  34. 重组病毒免疫小鼠后的PRRSV中和抗体 • GP5与M双基因共表达能有效提高针对PRRSV的中和抗体水平 • 以修饰的GP5m基因构建的重组病毒能显著提高PRRSV中和抗体水平，其中以TK-/gE-/GP5m+/M+最为明显。

  35. 重组病毒免疫小鼠后的PRRSV细胞免疫 TK-/gE-/ • 重组病毒免疫小鼠后均能产生特异性的淋巴细胞增殖反应。 • 以修饰的GP5m基因构建的重组病毒均能显著提高特异性细胞免疫反应，其中以TK-/gE-/GP5m+/M+最为明显。

  36. 重组疫苗对猪的免疫反应与攻毒保护 • 重组疫苗rPRV5m6 • PRRSV灭活疫苗 • 阴性对照 • PRV TK-/gE-/gI-

  37. Vaccine 28dc 42d 63d Neg control NAa -d - - ELISAb - - - PRRS KV vaccine NA - - - ELISA - - - TK-/gE-/gI- NA 17.3±9.4 38.3±22.6 32±17.5 ELISA 1280 20480 20480 rPRV-GP5m-M NA 13.4±11.6 38.4±25.7 35±11.9 ELISA 1280 20480 20480 重组疫苗产生的针对PRV的抗体

  38. PRRSV中和抗体检测

  39. 针对PRRSV的细胞免疫反应 • RV5m6免疫组PBMC中特异性针对PRRSV的淋巴细胞增殖显著高于灭活苗对照组，尤其在攻毒后RV5m6免疫组增殖水平迅速上升，表现出记忆T细胞免疫反应。

  40. 攻毒后体温变化 ℃ • 阴性对照于攻毒后体温出现明显的发热（>40℃），并且波动较大，KV免疫组出现一过性的发热，但RV5m6 一直未出现发热。

  41. 攻毒后的病毒血症和排毒

  42. 肺部组织病理变化 Neg control PRRSV灭活苗 重组疫苗 健康猪

  43. 肺门淋巴结病理变化 Neg control PRRSV灭活苗 重组疫苗 健康猪

  44. Groups Tissue Lymph nodes Tonsil Lung Spleen Kidney Sternal Mesenteric TK-/gE-/gI- +++++b +++++ ++++ +++ +++++ +++ PRRS KV vaccine ++ +++ +++ +++ +++++ + rPRV-GP5m-M - + - - +++ - Neg control +++++ +++++ ++++ +++ +++++ +++ 攻毒后病毒分布情况

  45. 研究表明： • 以伪狂犬病毒为载体共表达修饰的GP5m和M蛋白的重组疫苗能够同时诱发较强的针对PRV和PRRSV的免疫应答，具有较好的免疫保护，有望成为新一代安全、高效的PRRSV新型疫苗。 • 临床初步应用： • 免疫预防 • 对发病猪的紧急接种

  46. 正在开展的研究： • 进一步对ORF5基因进行修饰，目前已获得18个突变体，其中对ORF5进行糖基化修饰后的突变体ORF5/34-/51-较天然的GP5产生的中和抗体高100倍。 • 构建伪狂犬病-蓝耳病-圆环病毒-猪瘟的四价基因工程疫苗。

  47. 26s subgenomic promoter The framework of self-replicating DNA vaccines 26s subgenomic promoter “自杀性”DNA疫苗 • 以甲病毒复制子为载体，自主复制，保障外源基因的高效表达； • 诱导被转染细胞发生细胞凋亡，增强免疫提呈，避免常规DNA疫苗整合到宿主基因组、细胞转化等潜在的安全性隐患。 • 是一种更安全、更有效的新型核酸疫苗。

  48. pSFV-5m6 ORF5m SFV nsPs ORF6 P CMV polyA A69 26S 26S PRRSV“自杀性” DNA疫苗 DNA疫苗（18种） pCI-52 pCI-5m pCI-ORF6 pCI-56 pCI-5m6 自杀性DNA疫苗（4种） pSFV-52 pSFV-5m pSFV-56 pSFV-5m6 pCI-52/IL2 pCI-53 pCI-VP22/5m pCI-VP22/5m6 …… 中国授权发明专利（ZL200410000238.0）

  49. 自杀性DNA疫苗免疫猪后诱导的中和抗体

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