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DNA 重组技术 刘湘帆

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DNA 重组技术 刘湘帆. DNA 重组技术前言. 一、重组 DNA 技术的诞生 (一)重组 DNA 技术诞生的理论基础 1.40年代明确了遗传的物质基础是 DNA 肺炎链球菌. 2、50年代揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制. 3、50年代末和60年代提出了 “ 中心法则 ” 和操纵子学说,并成功地破译了遗传密码。 中心法则. 遗传密码 64个密码子 61个代表各种氨基酸( AUG 起始密码) 3个密码子为终止子( UAA、UAG、UGA). 操纵子 用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。.

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
dna dna 1 40 dna
一、重组DNA技术的诞生(一)重组DNA技术诞生的理论基础 1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA肺炎链球菌
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2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制

3 50 60
3、50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说,并成功地破译了遗传密码。中心法则3、50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说,并成功地破译了遗传密码。中心法则
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遗传密码 64个密码子 61个代表各种氨基酸(AUG起始密码) 3个密码子为终止子(UAA、UAG、UGA)

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操纵子用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。操纵子用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。
dna 1 dna 2 3 southern dna
(二)关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础 1.DNA分子的切割与连接技术 2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 3.Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链式反应
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二.重组DNA技术的定义及步骤(一)重组DNA技术1、重组DNA技术(recombinant DNA technology):按照人的意愿,在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞,使其在细胞中扩增和繁殖,以获得该DNA分子的大量拷贝,表达相关基因的产物,是进行基因功能研究的基本方法。

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2.克隆(clone):指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。2.克隆(clone):指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。

分子克隆(molecular cloning):

构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无

性繁殖体系。

dna 1 2 3
(二)重组DNA技术的重大意义 1.填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 2.缩短了进化时间。 3.使人能对生物体进行定向构造。
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第一节 常用的工具酶

工具酶:

DNA重组技术,需要利用一些酶在体外对

DNA进行切割、连接等基因操作,这些酶常被称

为工具酶。

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第一节 常用的工具酶

主要工具酶
  • 限制性核酸内切酶
  • DNA连接酶
  • 逆转录酶
  • DNA聚合酶Ⅰ
  • 碱性磷酸酶
  • 末端转移酶
  • Taq DNA聚合酶
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是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。
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一、限制性内切酶

1.简称限制酶,是DNA重组技术的基本工具

2.能识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶

3.在细菌体内与相伴存在的修饰酶(甲基化酶)共同构成细菌的限制-修饰体系,起限制外来DNA、保护自身DNA的作用

i ii iii
二.命名※第一个字母(大写、斜体) 该酶的微生物属名※第二、三个字母(小写、斜体) 代表微生物种名※第四个字母(斜体) 代表寄主菌的株或型※用罗马数码I、II、III等区分同一株具 有不同特异性的酶
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例 流感嗜血杆菌中三个酶的命名:Haemophilus influenzae d属名 种名 株系H in d I II IIIHind I Hind II Hind III

i ii iii1
三.分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为:I型II型III型
1 i dna
功能

核酸内切酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶

特点:

识别和切割位点不一致

没有固定的切割位点

随机切割

不产生特异片段

1.I型限制酶属于复合功能酶,兼有修饰和切割DNA两种特性。1.I型限制酶属于复合功能酶,兼有修饰和切割DNA两种特性。
2 iii i atp dna dna
2.III型酶与I型酶特性类似,也有甲基化功能,但无ATP酶和DNA解旋酶活力。在DNA链上有特异位点切割,其切割位点在识别位点以外。2.III型酶与I型酶特性类似,也有甲基化功能,但无ATP酶和DNA解旋酶活力。在DNA链上有特异位点切割,其切割位点在识别位点以外。
3 ii 1 ii 4 6 180 2 ii blunt end dna
3. II型酶(1)II型酶的识别 识别序列一般为4-6个碱基对,通常是反转重复顺序,具有180º的旋转对称性。(2)II型酶的切割功能★平末端(blunt end)在识别顺序的对称轴上,对双链DNA同时切割。
5 cohesive end dna 5
★5’端粘性末端(cohesive end)在识别顺序的双侧末端切割DNA双链,于对称轴的5’末端切割。
3 dna 3
★3’端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链,于对称轴的3’末端切割。
4 ii 1 isoschizomer
4.少数有特殊性质的II型酶<1>异源同工酶(isoschizomer)定义: 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。

5’ C C G G 3’

3’ G G C C 5’

5’ C C G G 3’

3’ G G C C 5’

HpaII、MspI

2 isocaudarner
<2>同尾酶(isocaudarner) 为识别与切割顺序相互有关的酶。 有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中 酶来源不同,但它们作用后能产生相同的粘性末端。

Bag II

BamH I

5’A G A T C C 3’

3’ C C T A G A 5’

5’G G A T C C 3’

3’ C C T A G G 5’

5’G G A T CC 3’

3’ CC T A GG 5’

dna dna
特点:两个同尾酶消化的DNA片段,可以相互连接,连接后的重组DNA分子,可以被其中一种酶识别,也可能原来的任何一个同尾酶均不能识别。特点:两个同尾酶消化的DNA片段,可以相互连接,连接后的重组DNA分子,可以被其中一种酶识别,也可能原来的任何一个同尾酶均不能识别。
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5.限制性内切酶活力单位和星号活力

(1)酶活力单位

限制性内切酶活力单位规定如下:在合适温度、pH值和离子强度等条件下,1小时内完全消化1μg特异DNA底物所需的酶量,定义为一个活力单位。

slide29
(2) 星号活性
  • 限制性内切酶在非标准反应条件下,对识别序列的特异性下降,能切割一些与特异识别顺序类似的序列,一般在酶的右上角加*表示。
  • 如克隆过程中需同时进行双酶切,应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系(可查阅试剂供应商手册获得),否则可能出现星号活性。
slide30
(3)特点:星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。(3)特点:星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。

GACTAGCNAATTNTACGCAATTT

CTGATCGNTTAANATGCGTTAAA

EcoRI*

slide32

(4)产生的原因a.高甘油含量(>5%V/V) b.内切酶用量过大,一般为>100U/g DNA c.低离子强度<25mmol/L d.高pH值 pH8.0 e.含有机溶剂:DMSO、乙醇、乙烯二乙醇 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在

5 ecor i hind iii kpn i pst i scai sal i xmn i hinf i bssh ii ecor v
(5)常见容量发生星号活力的酶有:EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、ScaI、SalI、XmnI、HinfI、BssHII、EcoRV(5)常见容量发生星号活力的酶有:EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、ScaI、SalI、XmnI、HinfI、BssHII、EcoRV
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(6)其他注意事项 :
  • 底物DNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚
  • 溶液不能含大于10mmol/L的EDTA、SDS和过量的盐
slide35
反应缓冲体系中一般加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇防止含巯基酶的氧化失活反应缓冲体系中一般加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇防止含巯基酶的氧化失活
  • 加入牛血清白蛋白稳定酶活性
  • 操作时应注意混匀反应体系,这也是常见的酶切失败原因之一
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6.甲基化酶许多细菌有限制-修饰系统限制(降解)外来DNA,并通过对自身DNA的修饰而起保护作用6.甲基化酶许多细菌有限制-修饰系统限制(降解)外来DNA,并通过对自身DNA的修饰而起保护作用

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Ⅱ类限制-修饰系统
  • 由两种酶分子组成的二元系统
  • 一种为限制性内切酶,另一种为独立的甲基化酶
  • 这两种酶识别序列相同
  • 如PstⅠ甲基化酶使A甲基化形成5′-CTGCmAG-3′

大肠杆菌株一般有dam甲基化酶和dcm甲基化酶

slide38
甲基化酶的应用
  • 甲基化酶亦是分子克隆的重要工具酶
  • 当制备克隆用双链cDNA时,外源DNA片段可用M.EcoR Ⅰ甲基化酶处理,使双链cDNA内部EcoR Ⅰ位点则因甲基化受到保护而不被切割
dna 1 dna i klenow 1 dna i 3
二、DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段)(1)大肠杆菌DNA聚合酶I特性:具有3种酶活性二、DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段)(1)大肠杆菌DNA聚合酶I特性:具有3种酶活性
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聚合酶功能

5’ 3’外切功能

3’ 5’ 外切功能

slide42

聚合酶

dATP

dTTP

dGTP

dCTP

5’ CCG

3’ GGCTATCGA5’

5’ CCGATAGCT3’

3’ GGCTATCGA5’

a.5’3’DNA聚合酶活性 底物:单链DNA模板及带3’羟基的DNA引物

slide43

b.3’5’外切酶活性 底物:带3’羟基的双链DNA或单链DNA、从3’羟基端降解DNA。对双链DNA链的外切核酸酶活性可被5’3’DNA聚合酶活性所封闭。

聚合酶

5’ CCGATAGCT3’

3’ GGC5’

5’ CCG3’

3’ GGC5’

A T A G C T

c 5 3 5 dna
c. 5’3’外切酶活性: 能从游离的5’末端降解DNA成为单核苷酸。

聚合酶

5’ CCGATAGCT3’

3’ GGCTATCGAAT5’

T

A

TA

5’ CCGATAGCT3’

3’ GGCTATCGA5’

2 klenow dna i 5 3 klenow 5 3 3 5
(2)Klenow片段 从大肠杆菌DNA聚合酶I中去除5’3’外切酶活性,即得Klenow片段。 其只具有 5’3’聚合酶活性3’5’外切酶活性
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35kD

76kD

5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶

5’ 3’外切酶

DNA聚合酶I全酶

苦草杆菌蛋白酶裂解全酶

5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶

Klenow片段

1 dna dna dna i
应用1.催化DNA切口平移反应,置备高比活DNA探针。(大肠杆菌DNA聚合酶I)应用1.催化DNA切口平移反应,置备高比活DNA探针。(大肠杆菌DNA聚合酶I)

DNaseI

DNA聚合酶I

dNTP

32P-dNTP

2 taq dna 1 dna thermus aquaticus 5 3 5 3 75 80 c
2 .Taq DNA聚合酶(1)特性: ①耐热的DNA聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus 中纯化而来的。 ②5’3’聚合酶活性 ③5’3’外切酶活性 ④最佳作用温度为75-80C

(2)用途①通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增②对DNA进行测序

slide50

3.反转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶,RDDP)(1)特性①催化从RNA为模板的DNA聚合反应 ②具3’5’RNA外切酶活性,能特异性降解RNA— DNA杂交分子中的RNA部分 ③具DNA指导的DNA聚合酶(DDDP)的功能 ④能以mRNA为模板催化合成出互补的DNA(cDNA)

2 amv rna h 3 5 42 c ph8 6
(2)分类①禽源反转录酶 来自禽或骨髓细胞瘤病毒(AMV) 具有聚合酶活性及强的RNA酶H活性 无3’5’外切酶活性。 温度42C pH8.6时活性较高
moloney m mlv rna h 3 5 37 c ph7 6
②鼠源反转录酶 来自Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)具有聚合酶活性及相对较弱的RNA酶H活性 无3’5’外切酶活性 温度37C pH7.6时活性较高
4 dntp dna 3
4.末端脱氧核糖核酸转移酶(末端转移酶) 催化dNTP加到DNA分子的3’羟基端
slide56

3’末端标记

添加多聚体尾

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三、DNA连接酶1.定义:DNA Ligases are primarily responsible for joining the gaps that form in DNA during replication(i.e., the joining of Okazaki fragments formed by discontinuous or lagging strand replication), DNA repair, and recombination.催化双链DNA一端的3’OH与另一双链DNA5’的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键,使具有相同粘性末端或平末端的DNA末端连接起来。

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三、DNA连接酶
  • 注意:DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。
  • DNA连接酶是重要的基因重组的工具酶

应用DNA连接酶将具有相同粘性末端或平端的DNA分子连接起来。

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DNA连接酶的特点:

T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶

T4噬菌体DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端

的DNA分子

大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端DNA分子

DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶

slide60
T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子

连接反应需要ATP、Mg2+和二硫苏糖醇,最适pH为7.2~7.4,ATP为连接反应提供能量,二硫苏糖醇可提高连接效率

slide61

2.分类:T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶

3.特点:催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间(切口)形成磷酸二酯键。切口(nick):DNA分子糖-磷酸主键的破坏。缺口(gap):DNA分子中核苷酸缺失。

slide63

5.反应例解:(1)互补粘端DNA(或切口间的连接)5’ACGOHpAATTCGT 3’ 3’ TGCTTAApHOGCA 5’ATP、Mg2+T4连接酶5’ACGAATTCGT 3’3’TGCTTAAGCA5’

2 5 c g a og p c g t a 3 3 g c t p oh g c a t 5 atp mg 2 t 4 5 cga cgta 3 3 gct gcat 5
(2)平端连接5’C G AOG pC G T A 3’3’ G C TpOHG C A T 5’ATP、Mg2+ T4连接酶5’CGACGTA3’3’GCTGCAT5’
t 4 t4 polynucleotide kinase t4 pnk atp dna 5
四、T4多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)催化将ATP的-磷酸转移到DNA链的5’末端

1.反应分类(1)前向反应 将ATP的-磷酸转移到脱磷酸的DNA链的5’末端

slide69

五、碱性磷酸酶alkaline phosphatase (CIAP)1.特性:催化去除DNA、RNA和dNTP的5’磷酸的反应。2.分类(1)细菌碱性磷酸酶(BAP)(2)牛小肠碱性磷酸酶(CIP)3.用途(1)在用T4多核苷酸激酶和32P标记5’末端前,去除DNA或RNA的5’磷酸。(2)去除DNA片段5’磷酸以防止自身环化。

slide70

CIAP is most commonly used to remove 5-phosphates from vector DNA to prevent selfligation during cloning

agctt tcgaa
AGCTTTCGAA

AAGCTT

TTCGAA

AAGCTT

TTCGAA

pAGCTT

A

A

TTCGAp

slide72

AAGCTT

TTCGAA

AAGCTT

TTCGAA

CIP

A

TTCGA

AGCTT

A

不能形成环化

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第二节 常用载体

一、质粒载体

二、噬菌体载体

三、穿梭载体

四、人工染色体

slide74
一、质粒载体

1. 质粒载体是应用最广的载体

2. 质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成

3. 这类质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复制。质粒扩增时,通过加入氯霉素抑制大肠杆菌蛋白质合成,达到进一步提高质粒拷贝数的目的

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一、质粒载体

理想质粒载体应具备特点

1. 松驰型复制子(如ColE1)

复制子(replicon)是质粒自我增殖所必需

2. 几个单一的酶切位点(或多克隆位点)

以便目的DNA片段插入

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一、质粒载体

3. 插入失活的筛选标记

  • 一般应具有两种抗菌素抗性标志
  • 如氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)等

4.分子量相对较小和较高的拷贝数

5.缺点:容量较小,一般只能接受小于15kb的DNA

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一、质粒载体

(一) pBR322质粒载体

(二) pUC质粒载体系列

pbr322

一、质粒载体

(一) pBR322质粒载体

pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一,至今尚在使用。

pBR322载体的组成

  • 源于ColE1的派生质粒pMB1的复制起始位点(ori)
  • 来源于pSF2124质粒易位子Tn3的Ampr
  • 来源于pSC101质粒的Tetr
pbr3221

一、质粒载体

pBR322质粒载体和特点

1. 带有一个复制起始点(ori)

2. 抗生素抗性基因(Ampr和Tetr)作选择标记

3. 数个单一的限制性酶切位点

当外源基因插入这些抗性位点时,就分别成为Amp敏感(Amps)或Tet敏感(Tets),即插入失活

slide80
一、质粒载体

4. 较小的分子量

易于自身DNA的纯化,而且能有效地克隆6kb大

小的外源DNA片段。

5. 较高的拷贝数

经氯霉素扩增后,每个细胞达1000~3000个拷贝。

slide81
一、质粒载体

r

r

pBR332质粒结构示意图

slide83
典型的pUC质粒载体有4个组成部分
  • 来自pBR322 质粒的复制起始点
  • Ampr基因
  • 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的启动子及其编码α-肽链的DNA序列,称为LacZ′基因
  • 位于LacZ′基因中靠近5′-端的一段多克隆位点区段,但并未破坏该基因的功能
slide84

一、质粒载体

pUC系列的优越性

最通用的大肠杆菌克隆载体之一

优点

  • 具有更小的分子量和更高的拷贝数
  • 构建pUC系列时仅保留了pBR322的复制子和Ampr
  • 具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ′基因,适应于组织化学筛选重组体
slide85
一、质粒载体

r

pUC18/pUC19质粒载体结构

slide86
二、噬菌体载体
  • λ噬菌体载体
  • 粘粒载体称柯斯质粒(cosmid)
  • 单链丝状噬菌体载体
slide87
二、噬菌体载体

λgt10(插入型)结构

slide88
二、噬菌体载体

75%~105%

Charon 40(替换型)结构

slide89
COS位点:γ噬菌体两端存在12bp的互补序列.
  • γ噬菌体载体可以存在两种生长方式:

溶菌性生长: γ噬菌体感染宿主后环化成并大量复制装配成γ噬菌体颗粒,最终导致宿主裂解.

溶源性生长: γDNA整合到宿主染色体基因组中,复制遗传给子代,宿主细胞不破坏.

slide90
二、噬菌体载体

粘粒载体组成:

质粒+ γ噬菌体

连接位点:通过COS位点形成

r

粘粒载体pJB8结构

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二、噬菌体载体

典型丝状噬菌体:

M13噬菌体

主要特点:单链闭环DNA分子

主要优点:可以获得和分离大量单链形式的DNA分子

M13mp18/M13mp19 结构

shuttle vector
三、穿梭载体(shuttle vector)
  • 带有原核和真核细胞的复制起始点
  • 常将真核生物的克隆载体构建成穿梭载体,使其先在大肠杆菌中扩增,将目的基因与之构成合适的重组体后,再转入真核细胞
  • 若加上适当的真核启动子等元件,则成为真核表达载体,能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因
shuttle vector1
三、穿梭载体(shuttle vector)

真核系统载体还必需具备适当的筛选标记

  • 一种筛选标记是,使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补(如TK基因产物)。
  • 另一种普遍使用的是抗新霉素基因。因此,真核克隆载体的构成一般由来自噬菌体、质粒和病毒的DNA元件构建而成。
shuttle vector2
三、穿梭载体(shuttle vector)

(一)SV40(猿猴病毒)载体

(二)逆转录病毒载体

slide95

三、穿梭载体(shuttle vector)

(一)SV40(猿猴病毒)载体

真核表达载体中的调控元件大都来源于SV40的调控顺序和复制信号

用SV40作为载体有两种方式

  • 用SV40 DNA与外源DNA构建重组子,转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒;
  • 重组子不包装成病毒颗粒,而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。
psvk3

三、穿梭载体(shuttle vector)

例:PSVK3质粒
  • PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体。
slide97
PSVK3具有下列构件:
  • 原核系统构件:①复制子和丝状噬菌体复制起始位点fl;②筛选标志(Ampr);③启动子(T7启动子)。
  • 真核系统构件:① SV40复制起始点;②SV40早期启动子
  • RNA修饰信号:①SV40小T抗原拼接信号;②SV40早期区mRNA polyA加尾信号。
  • 多克隆位点:SV40启动子下游有8个酶切位点。
slide99

三、穿梭载体(shuttle vector)

(二)逆转录病毒载体

逆转录病毒载体具有几个特点

  • 具有广泛的哺乳动物细胞宿主
  • 较大的容量,能插入7kb大小甚至更大的外源基因
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病毒基因组自身含有完整高效的调控元件
  • 病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞,并能有效地整合到宿主染色体基因组中,与染色体一起复制、长期存在
  • 逆转录病毒作为载体需要相应的外包装,以形成完整的体系
slide101

三、穿梭载体(shuttle vector)

逆转录病毒载体的局限性:

  • 逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体,并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞;
  • 装载容量较小,仅8kb左右,不适用于较大的基因;
  • 安性问题,最大的危险是制剂过程中可能存在具有复制能力的野生型病毒
slide103
四、人工染色体
  • 酵母人工染色体(YAC)
  • 细菌人工染色体(BAC)
  • 噬菌体P1衍生的人工染色体(PAC)
  • 哺乳动物人工染色体(MAC)
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四、人工染色体

YAC主要调控元件
  • 着丝粒 保证染色体细胞分裂过程中正确分配到

子代细胞

  • 端粒 防止染色体被核酸外切酶降解的功能
  • 复制起始点和限制性酶切位点
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筛选标记 YAC载体的两臂均带有选择标记,在酵母中选择标记一般为色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选
  • 原核序列及调控元件 包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等,以便于在大肠杆菌中操作
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四、人工染色体

YAC作为载体的主要特点
  • 酵母是单细胞真核生物,培养方便;
  • 酵母的真核细胞转录系统,有利于表达真核生物基因;
  • 装载容量巨大,可达Mbp水平;
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YAC的克隆程序相似于基因组DNA的常规克隆;DNA在片段连接到YAC载体的(两)臂上形成重组体,随后该重组体可通过常规方法导入酵母;YAC的克隆程序相似于基因组DNA的常规克隆;DNA在片段连接到YAC载体的(两)臂上形成重组体,随后该重组体可通过常规方法导入酵母;
  • 已广泛应用于各种生物基因组计划。
dna 1 2 3 dna 4 dna 5
重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获得和载体的选择2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获得和载体的选择2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化
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分离目的基因的方法及原理

目的基因分离方法的选择原则

目的基因的序列测定

(一)目的基因的分离

slide111

分离目的基因的方法及原理

  • 目的基因的定义: target gene

对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研究

或应用,首先需要通过克隆、扩增以获得该基因,

此基因(或片段)称为目的基因。

  • 外源性基因(或DNA):

cloned DNA in vitro

插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。

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目的基因的来源
  • 从庞大的基因群中获得某一目的基因的DNA

片段要求 ①纯度高;②数量多

  • 原核细胞(较易获得目的基因)

基因组较小,可直接分离获得

基因组 限制性内切酶 水解成若干

片段 探针筛选 提纯 扩增

slide114
真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择

1. 构建 cDNA文库

2. 构建基因组文库

3. 人工合成 Synthesize DNA in vitro

4. PCR扩增

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DNA文库:
  • 通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种DNA分子的集合体。文库保存了该种生物的全部遗传信息,需要时可从中分离获得。

1. cDNA文库 ——只包括表达成蛋白质的DNA序列

2. 基因组文库——代表该种生物体所有的DNA序列

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区域特异性cDNA文库 从特定位点的基因组DNA出发寻找转录序列

即以含有某种人染色体或其区段的杂交细胞株分离RNA,反转录合成cDNA

cDNA

(互补DNA,complementary DNA)

分类:

用人特异性Alu序列扩增,寻找外显子,可以得到染色体段内表达基因的分布图

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组织特异性cDNA文库 从cDNA出发寻找转录序列,将其定位于遗传图谱或物理图谱上。

即以不同发育阶段的人组织细胞为材料,提取RNA,构成cDNA文库。

可得到特定细胞的外显子图谱

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一、构建cDNA文库

cDNA以mRNA为模板经逆转录而成,

故须选择mRNA丰富、较易获得的、目的

基因表达活跃的组织细胞为材料。

1 mrna
1.真核细胞mRNA的分离和纯化
  • 提取细胞内总RNA
  • 分离和纯化mRNA

mRNA 3’端有polyA尾,用oligo-dT纤维

素亲和柱分离纯化mRNA。

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2. 逆转录合成cDNA

cDNA第一链合成

slide122

方法Ⅰ:①合成cDNA第一链

5’~~~~~~~~~~~~~~~~~~AAAAAA 3’ mRNA

TTTTTTT 5’ cDNA 1

Oligo(dT),反转录酶

d NTP,

②合成cDNA第二链

~~~ ~~~ ~~~ AAAAAA 3’ cDNA 2

TTTTTTT 5’

RNase H,DNA聚合酶, dNTP

5’ AAAAAA 3’ 双链 cDNA

3’ TTTTTTT 5’

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二、构建基因组文库

1. 分离纯化基因组DNA

条件应温和,以保证得到较长的DNA链

2. DNA片段与载体连接

基因组DNA 酶水解 具一定长度的片段(粘性末端)

载体(噬菌体等) 酶解 与目的基因连接

slide125
导入宿主细胞,携带基因组DNA片段的噬菌体或粘粒经包装后转入宿主细胞内培养扩增。插入基因组片段的集合体即基因组文库。导入宿主细胞,携带基因组DNA片段的噬菌体或粘粒经包装后转入宿主细胞内培养扩增。插入基因组片段的集合体即基因组文库。
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三、人工合成目的基因DNA片段

1. DNA的化学合成

2. DNA的酶促合成(首先需要有目的基因

DNA或与之互补的RNA链作为模板)

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一、根据获得目的基因的目的选择方法
  • 基因组文库

基因组全部测序、结构分析、基因识别,需构建基因组文库,从中获得基因(HGP)。

  • cDNA文库

研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用于生物制药等。

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二、根据目的基因的特点选择方法

包括某种生物的全部遗传信息,任何信息都可从中筛选,但某一个基因在其中所占比例很小,筛选难度大。

  • 基因组文库:
  • cDNA文库:
  • P C R:

包含所有正在表达的mRNA基因,不包含基因中的内含子和rRNA、tRNA等基因及所有不转录部分。

须知与目的基因特异互补的二端的引物。

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目的基因序列测定

目的基因序列测定

  • 精确研究该基因结构和功能的前提
  • 发现异常基因的依据。
sanger
一、双脱氧链终止法(Sanger法)
  • 原理
  • DNA链中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基团,在
  • DNA合成、链的延长过程中,新掺入的脱氧核苷
  • 酸5’-p与前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯
  • 键相连。
slide133
Sanger法是在反应体系中加入 2’, 3’ -ddNTP,由于其没有 3’-OH 而不能与下一个核苷酸相连,于是DNA链的合成便终止。
slide135

5′GAGTCACACTTGAC—— 3′待测单链DNA

3′CTG— 5′引物、Klenow酶、

dATP、dGTP、dCTP、dTTP

和少量α-32P-dATP

加ddTTP反应

3'TGAACTG— 5'

3'TGTGAACTG— 5'

3'TCAGTGTGAACTG5'

加ddATP反应

3'ACTG— 5'

3'AACTG— 5'

3'AGTGTGAACTG 5'

加ddGTP反应

3'GAACTG— 5'

3'GTGAACTG— 5'

3'GTGTGAACTG5'

加ddCTP反应

3'CAGTGTGAACTG— 5'

3'CTCAGTGTGAACTG5'

变性凝胶电泳、

放射自显影

GAGTCACACTT

A C T G

5

slide138
自动测序仪测序法 (ABI)

自动测序仪基于2,3-双脱氧末端终止法的原理,标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料,预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连,使其带有不同的荧光标记。当某一种ddNTP掺入到正在合成的DNA单链分子中时,该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。

自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机成像系统及分析软件组合。

slide139

序 列 图 谱

(ABI PRISM 377)

slide142
(二)目的DNA片段与载体的连接

DNA连接酶酶促生化反应

外源目的基因装入载体的过程,即基因重组

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T4DNA连接酶:ATP是辅助因子;

大肠杆菌DNA连接酶NAD+是辅助因子。

slide146
粘性末端的DNA分子最容易相互连接,连接效率也是最高的。粘性末端的DNA分子最容易相互连接,连接效率也是最高的。
  • 连接反应的最适合温度是12~16度
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克隆载体具备的特征:

1 载体必须具有自我复制和表达的能力

2 载体不能过大

3 载体与宿主细胞容易分离和纯化

4 具有两个以上的遗传选择标记,便于区别阳性和阴性克隆

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特征 功能

在宿主细胞内稳定 允许复制

能控制自身复制 在细胞内复制高拷贝数

大小较小 容易转化,进入宿主细胞

存在限制性内切酶单一 允许供体DNA插入和质粒环化

酶切位点

不能通过接合转移 阻止重组DNA进入菌群

易于检测的特性,具有 可以区分转化和未转化细胞

两个以上的检测位点

容易从细胞中分离 容易得到高产量重组体

dna 1 dna dna
(一)DNA重组的方法1、分类:粘端连接法 平端连接法 依据外源DNA片段末端的性质,以及质粒载体与外源DNA上限制酶酶切位点的性质来做选择。
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1 粘性末端连接法(cohesive end ligation)

最主要的连接方法

单一限制性内切酶——粘性末端

两个限制性内切酶——互补粘性末端

目的基因或DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端,通过连接酶将其连接。

slide152
◇同源粘性末端:相同一种内切酶产生的粘性末端或不同的内切酶产生的互补粘性末端。◇特点:得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点,原切割内切酶,重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。◇同源粘性末端:相同一种内切酶产生的粘性末端或不同的内切酶产生的互补粘性末端。◇特点:得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点,原切割内切酶,重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。
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kpnI

pstI

slide154
除了重组体以外,还有质粒分子的自身环化,重新形成完整质粒,这是基因重组中产生了假阳性。除了重组体以外,还有质粒分子的自身环化,重新形成完整质粒,这是基因重组中产生了假阳性。
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如何提高连接的效率,防止假阳性的产生?
  • 1 连接前使用碱性磷酸酶,去除载体5`端的磷酸抑制质粒的重新环化。
  • 2 调节外源DNA 和克隆载体的比例
  • 3 定向克隆,使用两个限制性内切酶
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2 同聚体加尾部连接法:

(homopolymeric tails ligation)针对平性末端或者不匹配的末端

利用末端核酸转移酶在一个分子的末

端加上poly(A);另一个分子3`末端加上

poly(T),在通过DNA连接酶形成重组

DNA分子。

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3 人工合成接头连接法
  • 人为的在目的基因的两端加上酶切位点,使得限制性内切酶酶切后与载体形成相同的粘性末端
1 dna dna 2 3
(1)目的基因或DNA片段的两端接上能够被某一 限制性内切酶识别的DNA序列(接头)(2)在该内切酶的酶解作用下,与载体获得 相同的粘性末端(3)连接
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(二)重组DNA分子转入宿主细胞
  • 什么是转化(transformation)?
  • 将重组DNA分子引入细菌(原核细胞),使其在细菌体内扩增及表达的过程。
  • 什么是转染(transfection)?
  • 将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程。
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宿主细胞 原核细胞:大肠杆菌 真核细胞:哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞
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1 重组体分子导入原核细胞
  • 感受态细菌:细菌表面正电荷增加,细胞壁和膜的通透性增加,利于DNA分子的吸附和吸收
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(1)CaCl2转化:
  • [原理]:当细菌处于0℃、二价阳离子(如Ca2+、Mg2+等)低渗溶液中时,细菌细胞膨胀成球形,处于感受态;此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,重组DNA在42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面,在丰富培养基中生长数小时后,球状细胞恢复原状并繁殖。
slide170
细菌处于0度,二价阳离子存在的低渗溶液中,细菌膨胀成球形,处于感受态。细菌处于0度,二价阳离子存在的低渗溶液中,细菌膨胀成球形,处于感受态。
  • 此时加热在42度的热冲击下进入细胞,在培养基上生长数小时后球形细胞恢复原状并繁殖。
  • 转化效率为105~106/ug
slide172

0℃

二价阳离子Ca2+、Mg2+

42℃

细菌

slide173
[关键点]: 细菌必须处于生长对数期 实验操作必须在低温下 设立已知质粒载体的阳性对照 不加任何质粒的空白感受态细菌阴性对照
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2 电击法(electroporation):

在高压脉冲下,细菌细胞表面形成暂时性微孔,重组DNA进入微孔后,脉冲结束,细胞恢复。

实验简单,不需要制备感受态菌,转化效率高109~1010/ug

dna dna1
[原理] 利用高压脉冲,在细菌细胞表面形成暂时性的微孔,重组DNA从微孔中进入,脉冲过后,微孔复原,在丰富培养基中生长数小时后,细胞增殖,重组DNA得到大量复制。
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2 重组体导入真核细胞

(1)CaCl2转化

(2)电击法

(3)磷酸钙-DNA共沉淀法

(4)DEAE-葡聚糖介导转染

(5)脂质体法

(6)显微注射法

slide181

(6)原生质体融合: 外源性DNA片段与噬菌体DNA载体连接后成为重组噬菌体DNA,经噬菌体外壳蛋白包装完毕以后,成为有感染能力的噬菌体颗粒。(7)脂质体法(liposomes) :带正电荷的N-[1-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-三甲铵硫酸二甲酯和二油酰磷脂酰乙胺,与DNA或RNA上带负电的磷酸基团结合,形成由阳离子脂质包裹DNA的颗粒,随后脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合,通过二者的融合将外源基因导入细胞。(8)细胞核的显微注射法:

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-

-

DNA

+

+

+

脂质体

+

+

+

细 胞

-

-

+

+

+

+

+

slide187
(一)根据载体的性状变化进行筛选
  • 1 根据载体的抗药性标记进行筛选
slide188
载体上的抗药基因:

抗氨苄青霉素基因

抗四环素基因

抗卡那霉素基因等

凡是转入了载体的细胞都获得了这种

抗药性,可以在平板上生长菌落。

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当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后,凡转入载体的细胞都获得了抗药性,能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落,而未被转化的宿主细胞不能生长。只带有一种抗药基因的载体组成的重组DNA,在琼脂平板上生长成菌落是不能被区分是否是真正含有重组DNA的抑或是空载体,需要进一步的鉴定。当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后,凡转入载体的细胞都获得了抗药性,能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落,而未被转化的宿主细胞不能生长。只带有一种抗药基因的载体组成的重组DNA,在琼脂平板上生长成菌落是不能被区分是否是真正含有重组DNA的抑或是空载体,需要进一步的鉴定。

dna dna2
根据载体抗药性标志插入失活选择 含有两个以上的抗药基因的载体,外源DNA片段插入其中一个基因,并导致这个基因的失活,就可用两个含不同药物的平板,互相对照,筛选含重组DNA的菌落,这就是插入失活效应。
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外源基因

抗Amp

抗Amp

抗Tet

抗Amp

抗Tet

抗Tet

不含有载体或重组DNA

重组DNA

空载体

slide198

β-半乳糖苷酶系统 载体:pUC、pGEM系列载体等 带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列,其中含有编码β-半乳糖苷酶(β- galatosidase)基因(LacZ基因)的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列,在编码序列中插入了一个多克隆位点,但不破坏阅读框架,不影响功能。

slide199

当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖苷酶C端编码序列时,此酶的N端序列和C端序列可以互补(成为α互补),产生具有酶活性的蛋白质(β-半乳糖苷酶),从而使宿主细菌在含有IPTG,X-gal的培养基上呈蓝色。 当多克隆位点有外源DNA片段插入时,破坏此酶的N端阅读框架,产生无α互补功能的N端片段,因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈白色。

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LacZ基因

-半乳糖苷酶

在X/gal培养基上呈现兰色

-半乳糖苷酶

X-gal X(发色底物)+gal(半乳糖)

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4 根据外源性DNA片段性状进行筛选

根据外源基因可能表达的蛋白质对缺

乏该蛋白的细菌的影响

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如果外源性DNA片段可编码产生蛋白质,并且该蛋白质为细菌生命活动所必需,可利用该蛋白质的性状进行筛选。 如亮氨酸是细菌生命活动所必需的,当外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因时,将该外源性DNA片段转入亮氨酸缺陷的细菌中,放入仅含亮氨酸的培养基中,只有能利用亮氨酸的细菌才能生长,因此,能生长的细菌即为含有外源性DNA片段。

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(二)根据重组DNA的结构特征进行筛选 1、重组DNA的快速裂解、鉴定 初步筛选方法,根据重组DNA大小和载体DNA大小之间的差别来区分的。 琼脂糖凝胶中进行电泳分离,紫外灯下观察并比较与载体DNA片段迁移率,初步判断是否有外源DNA插入。

2 dna
2、限制性内切酶图谱进行分析 限制性内切酶进行酶切,凝胶电泳分析是否有外源DNA的插入。
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3、核酸分子杂交方法进行鉴定 核酸分子杂交是核酸分析的重要方法,是鉴定重组DNA的最通用方法,杂交方法 适用范围菌落印迹杂交 检测细菌体固定在膜上后, 经裂解释放的DNA斑点杂交 检测未经凝胶电泳分离的, 固定在膜上的DNA或RNA原位杂交 直接检测细胞或组织中的DNA或RNASouthern 印迹杂交 检测经酶切、凝胶电泳分离的, 已转移到膜上的DNA Northern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离的, 已转移到膜上的RNA

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4 PCR反应进行鉴定

利用引物直接扩增外源基因进行检测

dna dna3
复习思考题名词解释重组DNA技术克隆限制性内切酶限制性内切酶的星号活力切口缺口DNA连接酶同工异源酶同尾酶复习思考题名词解释重组DNA技术克隆限制性内切酶限制性内切酶的星号活力切口缺口DNA连接酶同工异源酶同尾酶
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简答题1、限制性内切酶对双链DNA进行切割后可能产生的类型2、产生限制性内切酶星号活力的原因3、重组DNA技术中可能应用到的工具酶有哪些?简答题1、限制性内切酶对双链DNA进行切割后可能产生的类型2、产生限制性内切酶星号活力的原因3、重组DNA技术中可能应用到的工具酶有哪些?

4、CaCl2转化法的原理

5、重组子如何进行鉴定与筛选?