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医学免疫学实验

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Presentation Transcript

  1. 医学免疫学实验

  2. 一、凝集试验 吞噬试验 • 二、沉淀试验 溶血反应 • 三、免疫标记技术; 免疫细胞的分离; 细胞免疫功能测定

  3. 实验一 • (一)凝集试验 • 1、直接凝集反应(ABO血型鉴定) • 2、间接凝集反应(类风湿因子测定) • 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 • (二)吞噬试验(示教)(310室) • 1、中性粒细胞的吞噬作用(小吞噬) • 2、巨噬细胞的吞噬作用(大吞噬)

  4. (一)凝集试验 • 1、直接凝集反应(ABO血型鉴定) • 2、间接凝集反应(类风湿因子测定) • 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 (什么是凝集试验或直接、间接、协同凝集试验?)

  5. 免疫学检测技术 • 利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子(抗体、补体、细胞因子和粘附分子等)及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。 • 一、 抗原抗体的检测→凝集试验 • 二、 免疫细胞功能的检测→吞噬试验 • 三、其他,如细胞因子的检测

  6. 如何检测抗原或抗体?(基本原则) 抗原 + 抗体 抗原抗体反应现象 (抗原抗体结合反应的高度特异性) ? + 抗体 抗原 + ? 有现象(有相应抗原) 无现象(无相应 抗原) 有反应现象(有相应抗体) 无反应现象(无相应抗体)

  7. 抗原抗体反应的可见性与抗原抗体比例:(形成可见的大抗原抗体复合物合适条件:)抗原抗体反应的可见性与抗原抗体比例:(形成可见的大抗原抗体复合物合适条件:) Ab Ab Ag<<Ab: Ag ,游离Ab Ab Ag Ab Ab Ab Ag+Ab→ Ag-Ab→ Ag、Ab比例合适: (visible) Ag-Ab Ag (unvisible) Ab (凝集或沉淀) Ag Ag Ag>>Ab: ,游离Ag Ab

  8. Ab excess Ag excess Equivalence – Lattice formation (Visible)

  9. Immunecomplex Antibody excess zone Equivalence zone Antigen excess zone Antigen added

  10. 【凝集反应】: (1)概念: 颗粒性Ag+Ab →(凝集块) 可溶性Ag+Ab →(沉淀物) Ag Ab Ab Ab Ag-Ab Ag (细菌、细胞) Ab (凝集反应) Ag Ab Ab Ag-Ab Ag (蛋白质、多糖) (沉淀反应) Ab

  11. (2)类型 一定条件 颗粒性Ag+Ab 凝集块(直接凝集反应) 可溶性Ag-载体 + Ab → 凝集块(间接凝集反应) (细胞、细菌等) (正向间接凝集反应) 可溶性Ag + 载体-Ab → 凝集块(反向间接凝集反应) Ag + 金葡菌-Ab 凝集块(协同凝集反应) (致敏载体?)

  12. (3)凝集试验检测原理 一定条件 ①颗粒性Ag+Ab 凝集块(直接凝集反应) ? +已知Ab ② Ag + 金葡菌-Ab 凝集块(协同凝集反应) ?+金葡菌-已知Ab 凝集(有对应Ag) 一定条件 无凝集(无对应Ag) 凝集(有对应Ag) 一定条件 无凝集(无对应Ag)

  13. (一)1、ABO血型鉴定 直接凝集反应: 颗粒性抗原 + 抗体 凝集块 RBC 抗A或抗B 凝集块

  14. 血型 RBC抗原 抗A 抗B A A抗原 + - B B抗原 - + AB 有A、B + + O 无A、B - -

  15. 实验步骤: • 1、制备红细胞悬液。 • 2、加抗A或抗B。 • 3、加红细胞悬液。 • 4、结果观察。 • (2人/组)

  16. Bilateralis of the ring finger tip

  17. (一)2、血清类风湿因子测定 • 正向间接凝集反应、血球凝集试验: 可溶性Ag-载体 + Ab 凝集 人IgG-红细胞 类风湿因子 (致敏红细胞) (待测) (半定量) (效价)

  18. 效价(滴度):以出现明显抗原抗体反应现象(++及以上)的最高稀释度作为待检抗原(或抗体)的效价,可反应待检物含量。效价(滴度):以出现明显抗原抗体反应现象(++及以上)的最高稀释度作为待检抗原(或抗体)的效价,可反应待检物含量。 9 10 1.稀释液 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve 50ul 2.待检血清(1:10) (Ab?) 50ul 弃去50 50ul 50 50 50 50 50 50 Ab稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560

  19. 1.稀释液 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve 50ul 2.待检血清(1:10) (Ab?) 50 弃去50 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 3. 加Ag 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul 50 Ab最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 -++++ 1:320 4. 现象 ++++ +++ ++ ++ + + - - +++ ++ ++ + - - - - 1:160 ++ + + - - - - - 1:40 + - - - - - - - < 1:40 5. 效价>1:40,判断待检标本为抗体(类风湿因子)阳性;否则阴性 (效价)

  20. 可能结果1: 第1孔 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ++++ +++ +++ ++ ++ + - - - ++++

  21. Result 1: -ve control +ve control 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ++++ +++ +++ ++ ++ + — — — ++++ Agglutination deposition ++++ +++ +++ ++ ++ + — — — ++++

  22. standards to judge agglutination: ++++ all the red blood cells agglutinate +++ most red blood cells agglutinate ++ half red blood cells agglutinate  no agglutination all, agg.most, agg.half, agg.few, agg.no agglutination ++++ +++ ++ + -

  23. all, agg.most, agg.half, agg.few, agg.no agglutination ++++ +++ ++ + - ( +++ ) ( ++ )

  24. (result 1) Agglutination deposition ++++ +++ +++ ++ ++ + - - - ++++ 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 titer is 1:640; So, titer > 1:40, Test sample (sample serum) is positive. Rheumatoid factor is positive. Rheumatoid factor is at relatively high concentration.

  25. (result 2) Agglutination deposition ++++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ - ++++ 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 maybe, titer is 1:5120, or > 1:5120, So, titer > 1:40, Test sample (sample sera) is positive. Rheumatoid factor is positive, in high level. +

  26. (result 3) Agglutination deposition ++++ +++ +++ ++ ++ - - - - ++++ 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 titer is ?, (titer > 1:40, or titer < 1:40?) Test sample (sample serum, rheumatoid factor) is positive or negative?

  27. Titer: The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (≥++) is called the titer. • Titer: The highest dilution of the serum capable of agglutinating half of the red blood cells (++) is the agglutination titer. • The results are also reported as the reciprocal of the maximal dilution that gives visible agglutination.

  28. So, • Titer, 1:320 ( or 320), • Titer, 1:160 ( or 160), • Titer, 1:20 ( or 20),

  29. 29 • If Titer > 1:40 (or > 40 ), positive (Ab positive) • If Titer < 1:40 (or < 40 ), negative (Ab negative) • Titer, 1:320 ( or 320), >1:40(>40), rheumatoid factor positive • Titer, 1:160 ( or 160), >1:40(>40), rheumatoid factor positive • Titer, 1:20 ( or 20), <1:40 (<40), rheumatoid factor negative

  30. (一)3、协同凝集试验 Ag + 金葡菌-Ab →凝集块(协同凝集反应) 金葡菌 SPA 已知抗体 ( 致敏金葡菌 )

  31. 请按照实验指导讲义方法进行操作; • 注意观察第1格内的凝集现象,并分析第2、3格为何不出现凝集。

  32. 1. Ab- s.aureus Ab- s.aureus s.aureus • 2. CSF(Ag) normal saline CSF(Ag) • 3. joggle, • 4. (result) agglutinate × × • CSF: cerebrospinal fluid from the patient with meningitis, There are meningococcuses(Ag) in CSF from the patient with bacterial meningitis. • (two persons each group)

  33. 先做类风湿因子测定 • 微量移液器的使用

  34. How to Use a Micropipettor • Set the desired volume by turning the centrally located rings. (Never exceed the upper or lower limits of pipettors. 20~200ul) • Place a tip on the discharge end of the pipettor. • Depress the plunger until you feel the initial resistance and insert tip into the solution, just barely below the surface of the liquid and not as deep as possible.(for accurate/precise volume)

  35. Carefully and slowly release plunger. (Allow the pipet tip to fill to final volume before removing it from solution to avoid the presence of bubbles in the plastic tip.) • Discharge the solution into the appropriate container by depressing plunger. • Remember to change tips between solutions to avoid mixing or contaminating the solutions used.

  36. (二)非特异性免疫实验───吞噬试验(示教)(二)非特异性免疫实验───吞噬试验(示教) • 1、中性粒细胞的吞噬作用(小吞噬) • 了解小吞噬试验检测意义、原理,观察中性粒细胞及其吞噬的葡萄球菌;(310室) • 2、巨噬细胞的吞噬作用(大吞噬) • 了解大吞噬试验检测意义、原理,观察巨噬细胞及其吞噬的鸡红细胞。 (310室)

  37. 吞噬百分率= ×100% • 吞噬指数= ×100% 吞噬细菌的中性粒细胞数 观察记录的中性粒总数(100) 被吞噬的细菌总数 观察记录的吞噬细胞总数(100)

  38. Phagocytic cells monocyte neutrophil

  39. Phagocytic cells

  40. 脑膜炎奈瑟菌 中性粒细胞内的脑膜炎奈瑟菌_革兰染色

  41. 噬血细胞综合征 骨髓涂片中出现体积较大的噬血组织细胞,吞噬物为形态完整的白细胞,有核红细胞,成熟红细胞及血小板,亦可为不完整的细胞及细胞碎片等

  42. 噬血细胞综合征和噬血细胞 噬血细胞:巨噬细胞大小为20~40微米,或更大,胞浆丰富,吞噬多个成熟红细胞,或幼红细胞或血小板等

  43. Macrophage Attacking E.coli Innate immune response

  44. 返回

  45. 实验报告(今天交):

  46. 附:反复感染的儿童应该做哪些免疫试验 • 一、检查血清免疫球蛋白(即抗体)有无异常或缺陷 ; • 二、检查外周血象和淋巴细胞计数; • 三、做皮肤迟发性超敏反应试验;