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第二章 酶反应的基本原理

第二章 酶反应的基本原理. 一、酶的组成及其结构特点 二、酶的催化作用机理 三、酶的类型及命名 四、影响酶催化反应的因素. 提要：. 一、酶基本知识. 1.酶的概念 酶： 生活细胞产生的具有特殊空间构像的 , 能进行 生物催化作用的 生物大分子，包括蛋白质和核酸两类物质，其中以蛋白质为主。. （1）酶与一般催化剂的共性 用量少，催化效率高 不改变反应平衡点 可降低反应活化能 （2）酶的特性 高效性： 以酶的转换数 Kcat 表示， mol 底物 /mol 酶 .min

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第二章 酶反应的基本原理

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  1. 第二章 酶反应的基本原理

  2. 一、酶的组成及其结构特点 二、酶的催化作用机理 三、酶的类型及命名 四、影响酶催化反应的因素 提要：

  3. 一、酶基本知识 1.酶的概念 • 酶： • 生活细胞产生的具有特殊空间构像的,能进行生物催化作用的生物大分子，包括蛋白质和核酸两类物质，其中以蛋白质为主。

  4. （1）酶与一般催化剂的共性 用量少，催化效率高 不改变反应平衡点 可降低反应活化能 • （2）酶的特性 高效性：以酶的转换数Kcat表示，mol底物/mol酶.min 酶的Kcat为103-107 mol底物/mol酶.min，比非酶催化效率高107-1013倍。 专一性：结构专一性（相对专一性/绝对专一性） 立体异构专一性(几何异构/旋光异构) 温和性（不稳定性）：酶催化需要的活化能低，生物大分子，结构稳固性差。 可调控性：底物浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂等。

  5. 酶5 酶4 酶1 酶2 酶3 2、酶的聚集方式 • （1）松散排列 酶在细胞中各自以可溶的单体形式存在，彼此没有结构上的联系。 反应时酶是随机扩散，催化效率不高。（如糖酵解历程）

  6. C1酶 Cx酶 C酶 C0酶 C酶 C酶 • （2）簇式排列 几种酶有机地聚集在一起，镶嵌成一定的结构，形成多酶复合体。催化效率高。 （如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶、纤维素酶复合体）

  7. 酶3 酶1 酶2 酶4 酶5 • （3）与生物膜结合 一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链）

  8. 单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。 酶蛋白 （简单蛋白质） 酶 （apoenzyme） 辅酶（coenzyme) 双成份酶 辅因子 （结合蛋白质） （cofacter) 辅基(prosthetic group) 3、酶的组成

  9. 4、酶的结构层次 一级结构　　二级结构 　 三级结构 　 　四级结构

  10. 维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键 维持蛋白质结构的作用力 a盐键（离子键） b 氢键 c 疏水相互作用力 d 范德华力 e 二硫键 f 酯键

  11. 键作用力性能 • 氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 • 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 • 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 • 盐键数量小 • 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定 离子键 氢键 疏水相互作用力 范德华力

  12. 5、酶的活性基团及活性中心 活性中心：结合部位和催化部位 结合部位:决定酶的专一性 • 催化部位:决定酶所催化反应的性质。

  13. 酶活性中心示意图

  14. 部分酶活性中心的氨基酸残基 酶 残基总数 活性中心残基 牛胰核糖核酸酶 124 His12, His119, Lys41 溶菌酶 129 Asp52, Glu35 牛胰凝乳蛋白酶 245 His57, Asp102,Ser195 牛胰蛋白酶 238 His46, Asp90, Ser183 木瓜蛋白酶 212 Cys25, His159 弹性蛋白酶 240 His45, Asp93, Ser188 枯草杆菌蛋白酶 275 His46, Ser221 碳酸酐酶 258 His93-Zn-His95 His117

  15. E + S ES E +P 二、酶的催化作用机理 1、中间产物学说 • 中间产物存在的证据： • 同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）； • 吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。

  16. 2、诱导契合假说（induced-fit hypothesis） E-S复合物 S S a c b a b E c E 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。

  17. A B 酶 3、趋近效应与定向作用（ proximity effect & orientation arrange） 　底物和酶的活性中心结合在一有限区域内互相接近，趋近效应使底物在活性中心的局部浓度提高数干至数万倍，大大增加底物互相碰撞的机会。 定向即底物和酶的活性中心结合时，可诱导酶蛋白的构象变化，使底物和酶的活性中心更好地互补，并使底物有正确的定向。这样，底物的反应基团更趋近酶的催化基团。这又进一步使反应速度提高几个数量级。

  18. 4、底物分子的形变与扭曲张力学说（strain） • （1）酶受底物诱导发生构象改变，特别是活性中心的功能基团发生的位移或改向，呈现一种高活性功能状态。（2）酶活性中心的某些基团或金属离子可改变底物敏感健的电子云分布，产生“电子张力”而易于断裂，也可使底物的构象改变，接近过渡态　　而易于反应，这就是张力（）学说。　　羧肽酶A和溶菌酶的X线衍射分析证明了张力效应是酶催化的机制之一。

  19. 5、多元催化 (multielement catalysis) • 多元催化：多个基元催化形式的协同作用。一般包括酸-碱催化，共价催化（亲核催化, 亲电子催化）等。如凝乳蛋白酶：Ser-195亲核催化， His-57碱催化等； • 酸-碱催化：通过暂时提供（或接受）一个质子以稳定过渡态达到催化反应的目的；

  20. 广义酸基团 广义碱基团 pKa （质子供体） （质子受体） 酶活性中心广义酸碱基团

  21. 溶菌酶酸、碱催化反应示意图

  22. 共价催化（亲核催化, 亲电子催化）：通过催化剂与底物的共价键结合，形成过渡态来加速反应。共价催化具有亲核、亲电过程。 • 亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓的亲核攻击。 • 亲电催化：是由亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的催化反应,是亲核催化的反过程．

  23. 初速度 酶促反应速度逐渐降低 产 物 0 时 间 三、酶促反应动力学 酶促反应曲线

  24. 影响酶促反应速度的因素 • 底物浓度[S] • 酶浓度[E] • 反应温度 • pH 值 • 抑制剂 • 激活剂

  25. v Vm 0.3 0.2 Vm 2 0.1 [S]与v关系： 当[S]很低时，[S]与v成比例-- 一级反应 当[S]较高时，[S]与v不成比例 当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [S] 1 、底物浓度对酶促反应速度的影响 底物浓度对酶促反应速度的影响

  26. Vmax [S] V= Km + [S] （1）米氏方程（Michaelis-Menten equation） 米氏方程解释： 当[S]Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 正比于[S] 当[S]Km时，v Vmax, 即[S]而v不变 米氏方程成立条件： 初速度为标准 单底物 稳态（steady state）

  27. （2）米氏方程推导

  28. （3）米氏常数的意义 • 1、当反应速度等于最大反应速度一半时，即 V=1/2 Vmax, Km=[S],米氏常数的单位为摩尔/L 。 • 2、不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 • 3、Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH 条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 • 4、Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。

  29. 米氏常数Km的测定： 测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作图法 —双倒数作图法。 斜率=Km/Vmax 取米氏方程式的倒数形式： 1 Km 1 1  =  +  VVmax [S] Vmax -1/Km 1/Vmax

  30. 例题 D-丝氨酸脱水酶需要磷酸吡哆醛作为辅酶。催化反应： CH2OH · CHNH2 · COOH  CH3CO · COOH+NH3 在实验中测定酶的磷酸吡哆醛饱和曲线得到下列数据： [s] v 磷酸吡哆醛10 -5（M） 20分钟生成丙酮酸（M） 0.20 0.150 0.40 0.200 0.85 0.275 1.25 0.315 1.70 0.340 2.00 0.350 8.00 0.360

  31. 解：1、v对[S]作图法: 用这些数据求丝氨酸脱水酶对磷酸吡哆醛的表观米氏常数。 v Vm 0.3 0.2 Vm 2 0.1 丙酮酸M/20min Vm=0.36 1/2Vm=0.18 Km=3.210-6 M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 10-6 [S]

  32. 解2、1/v 对1/[S]作图法： 磷酸吡哆醛10 -5（M） 20分钟生成丙酮酸（M） [S] 1/[S] v 1/v 0.20 5.0 0.150 6.66 0.40 2.5 0.200 5.00 0.85 1.17 0.275 3.64 1.25 0.80 0.315 3.17 1.70 0.58 0.340 2.94 2.00 0.50 0.350 2.86 8.00 0.125 0.360 2.78

  33. 1/v 7 6 5 4 3 2 1 1/Vm=2.55 ; Vm=0.39 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 1/[S] -1/Km=-2.8510 5 Km=3.51 10-6

  34. k3[E][S] = k3[E] v= Km + [S] v o [E] 2、酶浓度对反应速度的影响 • 反应速度与酶浓度成正比：当[S][E],式中Km可以忽略不计。

  35. 3、温度对酶促反应速度的影响 产 物 麦 芽 糖 的 毫 克 数 2.0 1.5 1.0 0.5 0 10 20 30 40 50 60 ℃ 温度对唾液淀粉酶活性的影响 酶的最适温度: 酶活性最高时的温度, 也即酶的催化效率最高, 酶促反应速度最大时的温度。

  36. 4、pH对酶促反应速度的影响 酶 的 活 性 A B 2 8 10 pH pH对某些酶活性的影响 A: 胃蛋白酶; B: 葡萄糖-6-磷酸酶 酶的最适pH: 酶催化活性最高时的pH。

  37. 部分酶的最适 pH 值 酶 最适 pH 胃蛋白酶 1.8 过氧化氢酶 7.6 胰蛋白酶 7.7 延胡索酸酶 7.8 核糖核酸酶 7.8 精氨酸酶 9.8

  38. 5、抑制剂对酶促反应速度的影响 抑制作用: 直接或间接地影响酶的活性中心,使酶活性降低或丧失。 抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质。

  39. （1）不可逆抑制（irreversible inhibition） 抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合, 使酶丧失活性, 不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性. 例1： 巯基酶的抑制 SHS E + Hg2+ E Hg + 2H+ SH S SH Cl S E + As-CH=CHCl E As-CH=CHCl + 2HCl SHCl S 巯基酶 路易士气

  40. COONa CHSH CHSH COONa COONa CHS CHS COONa S E Hg + S SH E + Hg SH 二巯基丁二酸钠 S CH2OH SH CH2OH E As-CH=CHCl + CHSH E + CHS S CH2SH SH CH2S As-CH=CHCl 二巯基丙醇 解毒方法：

  41. 例2： 羟基酶的抑制 羟基酶: 有丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶 有机磷(敌百虫、敌敌畏、对硫磷)不可逆抑制羟基酶的活性中心 RO O RO O RO X RO O—E P + E—OH P + HX 有机磷化合物 羟基酶 磷酰化酶(失活) O OR O OR +E—OH RO O RO O—E P P + -CHNOH -CHN + + N N CH3 CH3 磷酰化酶(失活) 解磷定

  42. （2）可逆抑制(reversible inhibition) 抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失, 结合是可逆的, 能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。 可逆抑制类型： 竞争性抑制 (competitive inhibition) 非竞争性抑制（non-competitive inhibition） 反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）

  43. S S E E E + P I v 无 I 有 I I E [S] • （3）竞争性抑制(competitive inhibition) • 概念 竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞争同一种酶的活性中心,从而影响E与S的结合。 • 竞争性抑制作用过程 • 竞争性抑制的底物浓度曲线

  44. 竞争性抑制的动力学方程: Vmax[S] 1v Km Vmax 1 Vmax [I]Ki 1 [S] v= (1+ ) + = Km(1+[I]/Ki)+[S] • 竞争性抑制的特征曲线：  [ I ] 1v 正常 1 Vmax -1 1 [S] -1 Km [I] Ki Km(1+ )

  45. 竞争性抑制的特点： • I与S分子结构相似； • Vmax 不变，表观Km增大； • 抑制程度取决于I与E的亲和力 ，以及[I]和[S]的相对浓度比例。

  46. 例： COOH CH2 CH2 COOH COOH CH CH COOH 琥珀酸脱氢酶 + FAD + FADH2 丙二酸（-） COOH CH2 COOH 琥珀酸 延胡索酸 对氨基苯甲酸 二氢蝶呤 FH2 FH4 谷氨酸 二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶 磺胺药 (-) 氨甲蝶呤(-)

  47. S S E E E + P I I S S I I E E （4）非竞争性抑制 non-competitive inhibition） 概念 抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部位结合而抑制酶活性，I和S与酶结合不存在竞争关系。 非竞争性抑制作用过程：

  48. 非竞争性抑制的动力学方程: 1v Km Vmax 1 Vmax [I]Ki 1 [S] [I]Ki (1+ ) + = （1+ ） • 非竞争性抑制的特征曲线： 1v  [I] 1 Vmax [I]Ki (1+ ) 正常 -1 Km 1 [S]

  49. 非竞争性抑制的特点： 1、I与S分子结构不同； 2、Vmax 减小，表观Km不变； 3、抑制程度取决于[I]大小。 Ag 1+、 Cu 2+、 Hg 2+和 Pb 2+对酶的抑制 质子化的叔胺（R3NH+）对乙酰酯酶的抑制

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