肝病与肝癌中 EGFR 、 MMP 2 、 MMP 9 表达及比较曹晓蕾陈莉

肝病与肝癌中EGFR、MMP2、MMP9表达及比较 曹晓蕾陈莉

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是危害人类健康的常见肿瘤，尽管对其发生、发展、演化过程进行了大量的研究，但其发生机制尚未明了。对EGFR、MMP2、MMP9在肝癌发生发展中的作用尚未见报道。为此，本文采用免疫组化方法，检测比较在慢性肝病与肝癌中EGFR、MMP2、MMP9的表达，探讨其意义。

1.材料与方法 1.1材料：取南通医学院附属医院及周围市医院肝病蜡块标本47例，其中肝癌标本26例、慢性肝病(chronic hepatic disease,CHD)标本21例（包括肝炎、肝硬化）。连续切片4μm厚，贴于APES处理的载玻片上。EGFR、MMP2、MMP9及免疫组化试剂盒购于北京中山生物试剂公司。

1.2方法： ⑴HE染色切片病理观察，双盲法进行病理诊断。 ⑵免疫组织化学（SP法）检测EGFR、MMP2、MMP9在肝炎、肝硬化、肝癌组织中的表达。使用抗体为EGFR(Santa cruz Biotechnology Inc),工作浓度1：100;鼠抗人MMP9单克隆抗体（2M-0335）, 工作浓度1:50; 鼠抗人MMP2单克隆抗体(2M-0330), 工作浓度1:50。EGFR染色过程中使用胃蛋白酶消化，所有免疫组化切片经DAB染色，苏木素轻微复染。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替第一抗体作为阴性对照。

1.3判断标准： EGFR阳性定位于肝实质细胞胞浆中，呈棕黄色；MMP2、MMP9阳性定位于胞浆中，呈棕黄色，可见于肝癌细胞、间质Ito细胞、再生肝细胞、新生胆管细胞中。 1.4统计学处理：用x2检验，P值取小于0.05作判断差异显著标准。

2.结果 2.1 EGFR、MMP2、MMP9在CHD、PHC中的表达特征 EGFR在CHD中仅有较弱表达，阳性率仅为28.57%(4/21) ；在PHC中呈异质性表达，阳性率为73.08%(19/26)，并且呈较强表达。MMP2在CHD中呈较强表达，阳性率为76.19%(16/21) ； MMP2在PHC中呈较强表达，阳性率为80.77%(21/26) 。MMP9在CHD中有较弱表达, 阳性率为52.38%(11/21) ， MMP9在PHC中呈较强表达，阳性率为80.77%(21/26) 。

2.2 EGFR 、MMP2、 MMP9在PHC和CHD中的比较（表1） 表1 EGFR、MMP2、MMP9在PHC和CHD中表达的比较由表1可见， EGFR在PHC中表达的阳性率显著高于CHD中（x2=9.24，P<0.01）；MMP9在PHC中表达的阳性率显著高于CHD中（x2=4.31，P<0.05）；MMP2在PHC和CHD中表达的阳性率无显著差异（x2=0.15，P>0.05）。

2.3PHC中EGFR、MMP2、MMP9三者表达的比较 2.3.1 26例PHC中MMP2、MMP9表达阳性病例完全一致，即当PHC病例MMP2阳性时，MMP9亦呈阳性，26例PHC中MMP2、MMP9阳性21例，占80.77%；阴性5例，占19.23%。 2.3.2 PHC中MMP2、MMP9与EGFR表达的比较（表2）表2 PHC中MMP2、MMP9与EGFR表达的比较由表2可见，PHC中MMP2、MMP9与EGFR表达无显著差异（x2=0.538，P>0.05）。

2.4CHD中EGFR、 MMP2、 MMP9三者表达的比较 2.4.1CHD中MMP2、MMP9表达的比较（表3）由表3可见，CHD中MMP2、MMP9表达无显著差异(P>0.05)

2.4.2CHD中EGFR与MMP2、MMP9表达的比较（表4） 由表4可见，CHD中EGFR表达增高时，MMP2、MMP9表达减少，而EGFR表达阴性中有较多MMP2、MMP9表达，差异显著(P<0.05)

3.讨论 表皮生长因子受体（EGFR）是原癌基因C-erbB-1的表达产物，分子量为170 KD，属于穿膜受体烙氨酸激酶家族的成员，与细胞增殖、分化调节、肿瘤转化密切相关[1]。它在肿瘤形成中的作用日渐受到重视。许多肿瘤组织都有较高水平的EGFR的表达，并发现EGFR的表达与肿瘤的生物学行为有一定的相关性。本文发现，EGFR在CHD组织中阳性表达率较低（28.57%）,而在PHC中阳性表达率较高（73.08%）,经x²检验，EGFR在PHC、CHD中的表达有显著差异，EGFR的高表达与PHC有一定相关性。EGFR的高表达可能是其基因扩增和/或转录增加所致，因此，有人设想将EGFR作为治疗的靶抗原，将抗EGFR抗原的单克隆抗体与放疗或化疗剂连接制成“生物导弹”进行抗肿瘤治疗[2]，若这一设想能够实现，再加上本文所发现的EGFR在PHC中的高表达，就将为PHC的治疗提供一种新的思路。

基质金属蛋白酶是一类分解细胞外基质组分的锌蛋白酶[3]。它们在有机体的生长发育中的细胞外基质逆转与重塑以及疾病中的病理损害起着极为重要的作用。MMP2是相对分子量为72000的明胶酶A，MMP9是相对分子量为92000的明胶酶B，明胶酶（Ⅳ型胶原酶）主要降解基底膜、Ⅳ型胶原和明胶。明胶是形成间质中胶原的主要成分。在体内由巨噬细胞、结缔组织细胞和肿瘤细胞合成与分泌。

大量研究表明基质金属蛋白酶-2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9） 与多种肿瘤的侵袭有关[4]，但两者与PHC侵袭转移性的关系研究不多[5]。尤其是如何用两者来判断PHC是否具有侵袭转移性报道较少。本文发现，基质金属蛋白酶2(MMP2)在PHC、CHD组织中均有表达，阳性率分别为80.77%,76.19%,经x²检验，MMP2在PHC、CHD组织中表达无差异。在PHC中，癌组织，癌旁组织均有MMP2的表达，因此，不能单纯以有无MMP2的表达来判断PHC有无侵袭性。基质金属蛋白酶9(MMP9)在PHC、CHD组织中阳性率分别为80.77%,52.38%,经x²检验, MMP9在PHC、CHD中表达有显著差异。MMP9的高表达与PHC有一定相关性。

MMPS是ECM的降解酶，主要有三类：①间质胶原酶②明胶酶③间充质溶解素。在大多数恶性肿瘤中，MMPS家族的某些成员表达增高、活性增强，并与肿瘤病理分级相关，具有肿瘤诊断、鉴别诊断和判断预后的临床价值。肿瘤细胞在侵袭过程中需要基质金属蛋白酶对细胞外基质进行酶解，肿瘤细胞在转移过程中要先后经过进出毛细血管两个过程，在这两个过程中，肿瘤细胞必须穿过内皮细胞基底膜，而这一过程又必须依赖MMPS对基底膜成分的酶解。正因为如此，本文中MMP9在PHC中的高表达，可能造成肿瘤细胞在侵袭、转移过程中突破各种屏障如基底膜的能力大大增强，使肿瘤细胞易于发生转移。因此，MMP9在PHC中的高表达可能预示着PHC复发、转移率的提高，预后的不良。

肝癌组织中，肿瘤细胞活跃生长，表达较高的EGFR(73.08%)，同时也通过自分泌、旁分泌作用使癌细胞和间质细胞分泌较多的MMP2、MMP9，这与肿瘤进一步发展，降解ECM而侵润转移有关。肝癌组织中，肿瘤细胞活跃生长，表达较高的EGFR(73.08%)，同时也通过自分泌、旁分泌作用使癌细胞和间质细胞分泌较多的MMP2、MMP9，这与肿瘤进一步发展，降解ECM而侵润转移有关。

众所周知，大部分肝癌均伴有明显的肝病背景，慢性肝病中的显著特点是大量ECM沉积而合并肝炎肝硬化，肝细胞坏死，炎细胞被吸引到局部，活化Kuffers细胞、单核细胞及血小板释放多种增殖因子。TGF-α、EGF、TNF都使肝星状细胞活化，增生转化为肌成纤维细胞，后者产生大量ECM。炎症阶段是一个从基因活化到蛋白成分表达再到合成ECM在组织内沉积的过程。肌成纤维细胞在增殖过程中必然分泌基质金属蛋白酶，它可以使沉积的胶原降解。当胶原生成与降解失衡时，ECM过度沉积引起肝纤维化。随着纤维化加重，胶原酶合成减少，基质金属蛋白酶抑制剂(TMP)增多，后者抑制MMP的活性，阻止胶原降解，进一步加重纤维化。肌成纤维细胞增生过程中还能合成各种生长因子，通过自分泌、旁分泌形式促进本身增生，继续产生各种ECM成分，此时即使致病因子停止，肝纤维化仍可继续发展，最终发展为肝癌。众所周知，大部分肝癌均伴有明显的肝病背景，慢性肝病中的显著特点是大量ECM沉积而合并肝炎肝硬化，肝细胞坏死，炎细胞被吸引到局部，活化Kuffers细胞、单核细胞及血小板释放多种增殖因子。TGF-α、EGF、TNF都使肝星状细胞活化，增生转化为肌成纤维细胞，后者产生大量ECM。炎症阶段是一个从基因活化到蛋白成分表达再到合成ECM在组织内沉积的过程。肌成纤维细胞在增殖过程中必然分泌基质金属蛋白酶，它可以使沉积的胶原降解。当胶原生成与降解失衡时，ECM过度沉积引起肝纤维化。随着纤维化加重，胶原酶合成减少，基质金属蛋白酶抑制剂(TMP)增多，后者抑制MMP的活性，阻止胶原降解，进一步加重纤维化。肌成纤维细胞增生过程中还能合成各种生长因子，通过自分泌、旁分泌形式促进本身增生，继续产生各种ECM成分，此时即使致病因子停止，肝纤维化仍可继续发展，最终发展为肝癌。

正如本文观察到，慢性肝病中EGFR表达增加时，MMP2、MMP9均表达减少，可能是因为肝硬化形成中，肝细胞一方面增生形成假小叶，另一方面，大量纤维化及TMP增多使MMP2、MMP9合成减少所致。因此，临床对慢性肝病的治疗应注意保护肝细胞不受损伤，减少肝细胞增生，控制炎症，减少肝硬化程度，促进MMP2、MMP9的分泌。但是一旦肝癌形成，就要设法抑制MMP2、MMP9的分泌，减少癌细胞的侵润与转移。

4.结论 4.1 EGFR在PHC中显著高于CHD,说明EGFR表达与PHC有一定的相关。 4.2 MMP2、MMP9在PHC和CHD中表达比较无显著差异，在PHC中具有一致表达，在CHD中表达亦无显著差异。 4.3 PHC中EGFR表达与MMP2、MMP9表达无显著差异（P>0.05） 4.4 CHD中EGFR表达与MMP2、MMP9表达有著差异（前者P<0.01，后者P<0.05）说明肝病时的病理改变对MMP2、MMP9表达有较显著影响，提示MMP2、MMP9在CHD和PHC中可能有不同的作用机制，在CHD中MMP2、MMP9将能溶解胶原间质，减少肝硬化的发生，而在PHC，更多的MMP2、MMP9将能溶解癌间质，促进癌细胞的浸润与转移。

谢谢！

肝病与肝癌中 EGFR 、 MMP 2 、 MMP 9 表达及比较曹晓蕾陈莉