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实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳. 主讲：肖贵榜. 实验目的：. 掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的一般原理和方法。 熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中清蛋白与球蛋白的比值。. 实验 试剂：. 1 、 巴比妥 - 巴比妥钠缓冲液 (pH=8.6 ，离子强度 0.075) ：称取 2.768g 巴比妥和 15.458g 巴比妥 钠 , 置于大烧杯中，加蒸馏水约 600ml ，稍加 热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至 1000ml 。置 4 ℃ 保存，备用。

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实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

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Presentation Transcript

  1. 实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 主讲：肖贵榜

  2. 实验目的： • 掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的一般原理和方法。 • 熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中清蛋白与球蛋白的比值。

  3. 实验试剂： 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH=8.6，离子强度 0.075)：称取2.768g巴比妥和15.458g巴比妥 钠,置于大烧杯中，加蒸馏水约600ml，稍加 热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至1000ml。置4 ℃保存，备用。 2、氨基黑10B：氨基黑10B 0.5克, 甲醇50ml,冰乙酸10ml ,蒸馏水40ml 。 3、漂洗液：取无水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏 水50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。 3、0.4N氢氧化钠：称取氢氧化钠16.0g，蒸馏水 加至1000ml

  4. 氨基黑10B • 氨基黑10B ,苯胺蓝黑，酸性黑1,萘酚蓝黑，酸性黑10B，Acid Black 1

  5. 实验器材： 1. 电泳仪：为电泳提供直流电源。 2. 电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或X胶片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm 5. 其它：培养皿（直径9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。 DYY-Ⅲ型 电泳槽 DYY-5型稳压 稳流电泳仪

  6. 一、电泳的原理 实验原理： • 电泳：带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。

  7. 以蛋白质为例： H＋ H＋ OH－ OH－ pH>pI pH=pI pH<pI 蛋白质兼性离子 蛋白质阴离子 蛋白质阳离子 （等电点）

  8. 人血清中几种主要蛋白组分 • 缓冲液pH=8.6 • pI＜pH 血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。

  9. 醋酸纤维素薄膜电泳 它是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120mm。 优点：强渗透性，对分子移动阻力很弱，简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰和没有吸附现象。

  10. 电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即 V—粒子运动的速度 X—电场强度 Q—粒子所带电荷 r—粒子的半径 η—介质的粘度

  11. 影响电泳速度的主要因素 1.样品本身: 分子带电量：Q越多，u越大； 分子大小:分子小，r越小，u越大； 分子形状： 形状越小，与支持物介质摩擦 越小，u越大。 球形分子 > 纤维状分子

  12. A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大 2.缓冲溶液： B.离子强度(I)： 离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。 选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02～0.2之间。

  13. 3.电场强度(X): 电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。 X越大，u越快。支持物越短， X越大， u越快。 电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。

  14. 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳5条区带 依次分为清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白五个区带

  15. 二.定量操作 • 膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。 • 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。 • 可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。 • 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。

  16. 实验步骤： 1．准备与点样： 滤纸吸去多余的缓冲液 充分浸透在巴比妥缓冲液中 取两条2.5×8cm的膜条 取出膜条 垂　直 点　样 点样器下端粘上薄层血清 无光面距一端1.5cm处作点样线

  17. 点样操作示意图

  18. 2．电泳 膜条贴 紧滤纸，拉直膜条 平衡5 分钟 放　置 膜　条 点样面向下 点样端置于阴极 电压：160v 关闭 电源 通 电 时间：60 min

  19. 电泳装置

  20. 3．染色、脱色 浸于染色液（氨基黑10B）中 通电 完毕 取出 膜条 取出 膜条 3min 各5min 依次浸于漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 滤纸吸 干薄膜 直至 漂净

  21. 预试结果图（供参考）

  22. ４.定量 (两人的膜条共用) 取试管6支，编号1~6 充分振荡、脱净染料 15min 比 色、定 量

  23. 实验结果： 各样品吸光度值 仪器型号： 吸收波长： 仪器编号： 650nm

  24. 光密度总和T＝A＋α1＋α2＋β＋γ 1．计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。 清蛋白％＝（A / ∑T）×100％ α1球蛋白％＝（ α1/ ∑T）×100％ α2球蛋白％＝（ α2/ ∑T）×100％ β球蛋白％＝（β/ ∑T）×100％ γ球蛋白％＝（γ/ ∑T）×100％ 2．计算出清蛋白与球蛋白之比值（A/G） G=α1＋α2＋β＋γ

  25. 血清蛋白电泳结果的临床意义 临床上还可用A/G比来表示清球蛋白的量的关系： 　　　　　　　正常人A/G＝1.5～2.5

  26. 注意事项： • 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 • 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 • 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 • 4、点样后膜条的放置：区分电极正负极，膜条点样端接于负极且点样面向下。

  27. 5、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。5、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 • 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀。

  28. 思考与练习 • 1. 电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？ 根据人血清中各蛋白组分的性质，如何估计它们在pH8.6的巴比妥－巴比妥钠电泳缓冲液中的相对迁移速度？ • 2. 回顾醋酸纤维素薄膜电泳的原理和优点

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