实验五：血液生化样品处理 及组织样品的制备

1. 实验五：血液生化样品处理 及组织样品的制备

2. 目的要求 • 了解血液生化样品制备的原理；掌握血液生化样品制备的方法。 • 掌握离心机使用方法和注意事项

3. 一、血液生化样品制备 • 采血　测定用的血液，多由静脉采集。一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定。采血时所用的针头、注射器、盛血容器要清洁干燥；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。

4. 血清的制备 • 血清：全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄色液体。 • 血清的制备：由静脉采集的血液，注入清洁干燥的试管或离心管中。将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快的析出血清。为了缩短时间，也可用离心机分离(未凝或凝固后均可离心)，分离出的血清，用滴管移人另一试管中供测定用，如不及时使用，应贮于冰箱中。分离出的血清不应溶血。

5. 全血及血浆的制备 • 全血：采血前加入抗凝剂，包括了血浆和 血纤蛋白。 • 血浆：全血离心后除去血纤蛋白的液体。 • 抗凝剂：凡是能抑制血液凝固反应的化合 物称为抗凝剂。

6. 常用抗凝剂的使用方法 • 1、草酸钾(钠)。 其优点是溶解度大，与血液混合后，迅速与血中钙离子结合，形成不溶的草酸钙，使血液不再凝固。 • 配制方法：通常先配成10％草酸钾或草酸钠溶液，然后吸取此液0.1ml于试管中，转动试管，使其铺散在试管壁上，置80℃干燥箱内烘干，管壁呈白色粉末状，加塞备用。每管含草酸钾或草酸钠10mg，可抗凝血液5ml。 • 应用范围：适用于非蛋白氮、血糖等多种测定项目，但不适用于钾、钠和钙的测定；另外草酸盐能抑制乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶和淀粉酶，故使用时给予注意。

7. 草酸钾一氟化钠混合剂。 • 血液内某些化学成分(如血糖)离开机体后仍易被酶作用而影响测定结果。如用混合剂可抑制酶的作用(氟化钠有抑制糖酵解作用)，因而能防止血糖等化学物质的分解。 • 配制方法：称取草酸钾6g，氟化钠3g，加蒸馏水至lOOml，分装在试管内，每管0.25ml。80℃烘干后加塞备用。每管含混合剂22.5mg，可抗凝血液5ml。 • 应用范围：最适用于血糖的测定，而不适用于脲酶法的尿素氮测定(因氟化钠能抑制脲酶活性)。

8. 肝素 • 是一种较好的抗凝剂，因它对血中有机成分和无机成分的测定均无影响，其主要作用是抑制凝血酶原转变为凝血酶，使纤维蛋白原不能转化为纤维蛋白而凝血。 • 配制方法：常将肝素配成lmg／ml的水溶液，每管装0．1ml，再横放蒸干(不宜超过50℃)备用。每管可抗凝血液5～lOml。 • 市售肝素大多数为钠盐，可按10mg／ml配制成水溶液。每管装0.1ml，按上法烘干，可使5～lOml血液不凝固。 • 应用范围：适用于血液有机物的测定；不适用于凝血酶原的测定。

9. 乙二胺四乙酸二钠盐(简称EDTANa2) • EDTANa2对血液中钙离子有很大的亲和力，能使钙离子络合而使血液不凝固。 • 配制方法：常配成40mg／mlEDTANa2水溶液，每管分装0.1ml，在80℃干燥箱内烘干备用。每管可抗凝血液5ml。 • 应用范围：适用于多种生化分析，但不适用于血浆中含氮物质、钙及钠的测定。

10. 血浆的制备 • 血浆的制备由静脉采集的血液，放人装有抗凝剂的试管或离心管中，轻轻摇动，使血液与抗凝剂充分混合，以防小血块的形成。抗凝血可静置或离心沉淀分离(2000r／min,10min)，以使血细胞下沉，上清液即为血浆。血浆与血清成分基本相似，只是血清不含纤维蛋白原。

11. 无蛋白血滤液的制备 • 多生化分析要避免蛋白质干扰，常常先将其中蛋白质除去；分析血液中许多成分时，也常常需要除去蛋白质，制成无蛋白质的血滤液。制备无蛋白血滤液的方法很多，可根据不同的需要加以选择。现将生化常用的无蛋白血滤液制备方法介绍如下：

12. 钨酸法 • 原理：血液中的蛋白质在pH小于其等电点时，可用钨酸来沉淀。钨酸钠与硫酸混合产生钨酸和硫酸钠，游离的钨酸被，蛋白质吸附，形成不溶性的钨酸蛋白而沉淀，经过滤或离心，除去沉淀即得无蛋白的血滤液。 • 试剂： • ①10%钨酸钠溶液；②0.333mol／L硫酸溶液。 • 仪器与器材：锥形瓶、吸管、奥氏吸管、滤纸、漏斗或离心管及离心机。

13. 方法与步骤： • ①取50ml锥形瓶1只，加入蒸馏水7份；②用奥氏吸管吸取抗凝血l份，擦去管壁外血液，将吸管插人锥形瓶中水的底部，缓慢地放出血液。放完血液后，将吸管提高吸取上清液再吹人，反复洗管3次。充分混合，使红细胞完全溶解； ③加入0.333mol／L硫酸溶液1份，随加随摇，充分混匀。此时血液由鲜红变成棕色，静置5～10min，使其酸化完全；④加入10％钨酸钠溶液1份，边加边摇，血液由透明变成凝块状。当振摇到不再产生泡沫为止；⑤放置数分钟后用定量滤纸过滤或离心除去沉淀，即得完全澄清的无蛋白血滤液，供测定用。 • 用此法制得的无蛋白血滤液为10倍稀释的血滤液。即每毫升血滤液相当于全血0.ml，适用于葡萄糖、非蛋白氮、尿素氮、肌酸酐和氯化物等的测定。

14. 三氯醋酸法 • 原理：三氯醋酸是一种有机强酸，可使血液中蛋白质变性而形成不溶的蛋白质盐沉淀。其上清液即为无蛋白血滤液。此液呈酸性，常用来测定无机磷等。 • 试剂：10％三氯醋酸溶液。 • 仪器与器材：锥形瓶、刻度吸管和奥氏吸管、滤纸、漏斗或离心管和离心机。

15. 方法与步骤：①取9份10％三氯醋酸放人锥形瓶中；②加入抗凝血1份，边加边摇，静置5min；③过滤或离心，即得完全澄清的无蛋白血滤液，此液亦为10倍稀释之血滤液。方法与步骤：①取9份10％三氯醋酸放人锥形瓶中；②加入抗凝血1份，边加边摇，静置5min；③过滤或离心，即得完全澄清的无蛋白血滤液，此液亦为10倍稀释之血滤液。 • 附注 • (1)等无蛋白血滤液时，各液加妥后，摇匀不应有泡沫，否则表明蛋白质沉淀不完全。 • (2)所得无蛋白血滤液均应是五色透明的液体，如呈粉红色则说明蛋白质沉淀不完全。

16. 二、离心机使用方法

17. 离心分离技术是根据物体在一个实用离心场合中的状态而发展起来的新技术。不同密度、大小或形状的物质在不同速度的离心场合中沉降，所以一个大体是球形非均一的混合物，可以用离心的方法加以分离，离心机是为了进一步研究生物化学、分离大量的物质。例如：收集细胞，分离血浆。从这些预纯化的制剂中分离DNA和蛋白质分子，并可分离出病毒和大规模大肠杆菌、亚细胞成份、核蛋白微粒。

18. 使用方法 1．将离心机放在坚实而平整的工作台上； 2．在适用的离心管中加入样品，按离心机转头的离心管位置刻度所对应孔插入，必须注意对称配重，否则会损坏离心机； 3．放下离心机顶盖； 4．检查确认调速钮处于最低速位置； 5．打开电源开关； 6．调速到需要的转速 7．选择工作时间，调“选时”钮到需要的位置。

19. 注意事项 1．严禁各种液体和杂物进入离心工作室，那样会损坏主机； 2．仪器电源线应有良好的接地，以免发生意外； 3．离心机工作时不要打开顶盖； 4．电压的高低以及不稳定现象直接影响本机的转速（但不会损坏电机）。对转速要求较高的使用场合，请使用稳压装置，使运转速度稳定。