第三节紫外 - 可见分光光度计

图分光光度计结构方框示意图 吸收池光源单色器检测器显示器第三节紫外-可见分光光度计一、仪器基本组成紫外-可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池、检测器及显示器五部分组成。

一、仪器基本组成 （一）光源对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。 1. 钨及碘钨灯：340~2500 nm，多用在可见光区； 2. 氢灯和氘灯：160~375nm，多用在紫外区。激光光源近年也有用氩离子激光器或可调谐染料激光器发射的激光作光源，这种激光光源单色性好，光强度大，稳定性好。

一、仪器基本组成 • （二）单色器(Monochromator) 单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置。其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。

2 1 4 3 5 6 （二）单色器(Monochromator) 由入射狭缝（2）、出射狭缝（5）、准直镜（3）、色散元件（4）等组成。能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。图单色器光路示意图 1. 复合光2. 入射狭缝 3. 聚焦和准直镜 4. 色散元件 5.出射狭缝6. 单色光

一、仪器基本组成 （三）吸收池（Cell，Container）：用于盛放样品。石英适于紫外区和可见光区玻璃只适于可见光区有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。盛放参比溶液和样品溶液的一组吸收池要挑选配对。即有相同的厚度和透光性能。

一、仪器基本组成 （四）检测器 • 检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。硒光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。光电管（真空光电二极管）在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。

(四)检测器 • 在光谱分析中，光电池、光电管和光电倍增管属于单道光子检测器； • 光学多道检测器有光二极管阵列检测器、电荷偶合阵列检测器。

(四)检测器 • 光二极管阵列检测器（photo-diodearray detetor） • 近年来采用光二极管阵列检测器的仪器逐渐增多，光二极管阵列是在晶体硅上紧密排列一系列（几百个）光二极检测管，将其放在单色器的聚焦面处，每一个光二极管相当于一个单色器的出射狭缝，可同时测量不同波长的光谱线强度。两个光二极管中心距离的波长单位称为采样间隔。光二极管数目越多，分辨率越高。通过计算机控制，采用同时并行的数据采集方法，在不到一秒钟的时间内，可检测到仪器整个波长范围内的全部数据，获得全光光谱。

（四）检测器 • 电荷偶合阵列检测器（charge-coupled device array detector，CCD） • 具有更先进、更理想的检测性能，已开始在高档光谱仪器中使用。

一、仪器基本组成 • （五）显示器（信号指示系统）它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。

二、紫外可见光度计仪器 • 分光光度计分为单波长和双波长仪器。 1.单波长单光束分光光度计 2.单波长双光束分光光度计 3.双波长分光光度计 4.多通道分光光度计

参比池 检测器光源单色器样品池二、紫外可见光度计仪器 • 1.单波长单光束分光光度计经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。 • 721型分光光度计是简单的单波长、单光束可见分光光度计。

调制马达 单色器光源参比吸收池检测器样品吸收池二、紫外可见光度计仪器 2.单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计光路示意图

二、紫外可见光度计仪器 2.单波长双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。

二、紫外可见光度计仪器2.单波长双光束分光光度计二、紫外可见光度计仪器2.单波长双光束分光光度计 • 双光束优点吸光度的大小不受入射光强度的影响，可以减少或消除因光源强度不稳定而引入的误差，这正是双光束分光光度计的优点所在。

单色器 光源检测器单色器吸收池切光器双波长分光光度计示意图 3. 双波长分光光度计通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差A。 λ1 λ1λ2 λ2

3. 双波长分光光度计 • AB1和AB2分别为在1和2处的背景吸收，当1和2相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得 • 这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。

3. 双波长分光光度计 • 特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。

4.多通道分光光度计 使用光二极管阵列检测器特点：具有多路优点，信噪比高，测量快速，整个光谱的记录时间仅需1s左右。可检测到仪器整个波长范围内的全部数据，获得全光光谱。

第四节紫外－可见吸收光谱法的应用 一、定性分析二、定量分析三、平衡常数测定

第四节 紫外－可见吸收光谱法的应用一、定性分析 • 不同的物质分子有不同的紫外－可见吸收光谱，吸收光谱上的一些特征吸收，包括最大吸收波长（max）、最小吸收波长（min）、肩峰（sh）、末端吸收、吸光系数、吸光度比等是定性鉴别的常用特征参数。通常可通过比较这些参数进行定性鉴别。 • 用分光光度计进行定性鉴别时，要求样品是纯物质，而且对仪器的性能要求较高，须经过校正。

一、定性分析 （一）定性鉴定 • 用紫外－可见吸收光谱及特征参数进行定性鉴别时，给出的仅是官能团的信息，有一定的局限性。当两种纯化合物的吸收光谱有明显差别时，可以肯定两者不是同一化合物。但当两种纯化合物的吸收光谱完全相同时，只能得出两化合物含有相同的官能团，有可能是同一物质，但不能以此确定是同一物质，必须结合其它的定性手段才能进一步确证。常用的定性参数：ε

一、定性分析 （二）纯度检测 • 相同的物质应有相同的紫外－可见吸收光谱。纯化合物的吸收光谱与其含有杂质时的吸收光谱有差别时，可用紫外－可见分光光度法检查杂质。杂质检测的灵敏度取决于待测物与杂质两者之间吸光系数的差异程度。例如，乙醇中可能含有少量苯，苯的max为256 nm，而乙醇在此波长处几乎无吸收，乙醇中含苯量达0.001%就能从光谱中检测出来。

图标准曲线 二、定量分析（一）单组分样品的定量分析方法 1. 标准曲线法 • 配制一系列不同浓度的标准溶液，选择合适的参比溶液，在相同条件下分别测定各标准溶液的吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度为横坐标，绘制A－c曲线，即为标准曲线（standard curve），或称工作曲线（working cure）。 • 或进行线性回归，求出回归方程，绘出回归直线以代替标准曲线。 A Ax cx c

（一）单组分样品的定量分析方法 2. 直接比较法在相同条件下，制备标准溶液和样品溶液，分别测定两者的吸光度As和Ax，A=Kc,按下式计算样品溶液中待测组分的浓度cx。这种方法比较简便，适合个别样品的测定，但要求样品溶液与标准溶液的浓度相近，且在标准曲线的线性范围之内，标准曲线经过原点，这样才可获得准确的测定结果。

（二）多组分样品的定量分析方法 1. 解线性方程组法 • 由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。 • 设试样中有两组份 X 和 Y，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：

（二）多组分定量方法 1. 解线性方程组法 • 图a)：X,Y 组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。 • 图b)和c) ：X,Y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和Y的浓度： • 其中，X,Y 组份在波长 1 和 2 处的摩尔吸光系数  可由已知浓度的 X, Y 纯溶液测得。解方程组可求得 cx 及 cy。

（二）多组分定量方法2. 等吸收双波长测量法 • 其方法是：先把一种组分的吸收设法消去，测定另一组分的浓度。 • 测定a组分时，选择a组分的最大吸收波长作测定波长2，由A的峰顶2向横坐标作垂线与b吸收曲线的一侧相交，从相交点作横坐标的平行线与b吸收曲线的另一侧相交，交点所对应的波长为参比波长1。

2. 等吸收双波长测量法 b a a b • 测定波长2 • 参比波长1 选择两波长应符合的条件：（1）干扰组分在该两波长处的吸光度相同（2）被测组分在该两波长处的吸光度差（△A ）要足够大 λ1 λ2 λ2 λ1 图等吸收双波长测定法示意图（1）消去a，测定b （2）消去b，测定a

2. 等吸收双波长测量法 • 在2和1处分别测量吸光度然后相减由于b组份在两波长处的吸光度相等，

A A A a a a b b b λ λ λ 3. 系数倍率法情况同等吸收双波长测量法。但其中一干扰组份 b在测量波长范围内无吸收峰时，或者说没有等吸收点时可采用该法。

3. 系数倍率法 具体做法：同前法可得到下式，两式分别乘以常数Ｋ1、Ｋ２并相减，

3. 系数倍率法 调节信号放大器，使干扰组分b在波长2和1处的信号相等，由此得系数倍率K，因此，差示信号S 只与 ca 有关，从而求出 ca。同样可求出cb。

图各阶导数光谱图 零阶一阶二阶三阶四阶 4. 导数光谱法 • 导数光谱法又称微分光谱法，也是一种消除光谱干扰的方法。 • 导数光谱峰形尖锐、信息量大，灵敏度高，分辨率好，而且通过选择适宜的波长和求导条件，可消除背景吸收、杂质和共存物的干扰。 • 在导数光谱中，导数信号与浓度成正比。

三、平衡常数测定 弱酸离解常数的测定设有一元弱酸HB，其离解反应如下：若测出[B-]和[HB]，即可求出Ka。

弱酸离解常数的测定 测定时，配制三份不同pH值的溶液。一份为强碱性，一份为强酸性，分别在B-和HB的最大吸收波长处测定吸光度，求出各自的摩尔吸光系数。第三份为已知pH值的缓冲溶液，分别在B-和HB的最大吸收波长处测得总吸光度，解联立方程求得[B-]和[HB]，然后按前式求出pKa或Ka。

三、平衡常数测定 • 例题，用分光光度法测定以下反应的平衡常数：配位剂的量至少比Zn2+大5倍，此时的吸光度仅决定于Zn2+的摩尔浓度。

三、平衡常数测定 • 解：配位剂的量至少比Zn2+大5倍，此时的吸光度仅决定于Zn2+的摩尔浓度。

由吸光度0.540的溶液计算平衡时 各离子的浓度

第五节分光光度法分析条件的选择 一、测量条件的选择波长、狭缝宽度、吸光度读数范围、参比溶液二、反应条件的选择 1.显色剂用量 2.溶液的酸度 3.显色时间 4.温度 5.溶剂三、共存离子的影响及消除

第五节分光光度法分析条件的选择 一、测量条件的选择（一）波长的选择通常，选λmax作为分析波长，灵敏度高，而且在 λmax附近吸光度随波长变化小，测定误差也小。当最大吸收波长处有干扰或最强吸收峰的峰形尖锐时，为减少谱带宽度对测定的影响、消除干扰，常选用吸收峰稍低、峰形较平坦的次强峰或肩峰的波长进行测定，以减小对比尔定律的偏离。根据“吸收大，干扰小”的原则来选择分析波长。

（二）狭缝宽度的选择 • 狭缝宽度增大，入射光单色性变差，测定的灵敏度下降，工作曲线偏离比尔定律，吸收光谱的精细结构消失。 • 狭缝宽度过小，光通量减小，则须增大检测信号的放大倍数，但同时也放大了噪声，影响测定的准确度。 • 合适的狭缝宽度，应以吸光度不再减小时的最大狭缝宽度为标准。

（三）吸光度读数范围的选择 仪器的透光率测量误差（△T）来源于仪器的噪声，它取决于仪器的精度，不同精度的分光光度计有不同的△T （1%～0.01%）。分析结果的相对误差由于透光率与样品浓度的非线性关系－lgT=abc（对数关系），因而在不同的透光率范围，这一恒定误差所引起的分析结果的相对误差（）是不同的。由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。

（三）吸光度读数范围的选择 • 分析结果相对误差与透光率测量误差可由朗伯－比尔定律导出： • 对上式微分，得待测溶液分析结果的相对误差（）与透光率测量误差的关系为：

（三）吸光度读数范围的选择 • 透光率T的刻度是均匀的，△T(绝对误差)与T本身大小无关，对于一台仪器， △T是常数，一般在0.002～0.01之间。 △T确定时，是T的函数，如下图所示。

△ （三）吸光度读数范围的选择 • 当透光率T在65%～15%（A=0.20～0.8）的范围内，测定结果的相对误差（）较小， • 透光率T为36.8%（吸光度A为0.434）时，测定结果的相对误差最小。图测定结果相对误差与透光率（吸光度）的关系

（三）吸光度读数范围的选择 • 光度误差这种在不同的吸光度范围内，引入的不同程度的浓度相对误差称为光度误差。 • 吸光度A在 0.20～0.80 范围（T在65%～15%），误差较小。 • 在实际工作中，可通过稀释溶液、改变吸收池的厚度使吸光度值在所要求的范围内。

（四）参比溶液的选择 • 测量样品溶液的吸光度之前，需用参比溶液（reference solution）或称空白溶液（blank solution）调节吸光度零点A＝0（T＝100％）， • 其作用是消除干扰不仅能抵消吸收池和溶剂对入射光的影响，还可以抵消溶液中其它共存组分（包括显色剂、基体成分、辅助试剂等）在测定波长处产生吸收所引起的干扰。 • 所以，分析中应视样品溶液的性质选择合适的参比溶液。

（四）参比溶液的选择 1. 溶剂参比 • 当样品溶液中只有待测物质在测定波长下有吸收，其它共存物质均无吸收时，采用溶剂（通常为蒸馏水）作为参比溶液。 2．试剂参比 • 当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物），相当于标准曲线系列的零（0）管 • 许多显色反应需采用试剂参比。

第三节 紫外 - 可见分光光度计