Pharmakogenomik

Pharmakogenomik Dr. Peter Ahnert ahnert@uni-leipzig.de http://www.uni-leipzig.de/~ahnert 07.11.2007

Übersicht • Definition “Pharmakogenomik” • Pharmakogenomik und Wirkstoffentwicklung • Identifizierung der genetischen Komponente einer Erkrankung • Assoziationsstudien • Genetische Variabilität • Struktur von Assoziationsstudien • Kandidatengen-Selektion • SNP-Auswahl • Genotypisierung • Datenanalyse • Genomweite Studien • Beispiele

Pharmakogenomik – Eine Definition • Pharmakogenomik verbindet Pharmakologie mit (genomweiter) Genetik (Genomik). • Verbindet die Erbanlagen von Individuen mit deren Suszeptibilität für Erkrankungen und ihrer Reaktion auf Wirkstoffe und Behandlungsmethoden um die Entwicklung und Anwendung neuer Wirkstoffe und Therapien zu unterstützen. Basiert auf humaner genetischer Variabilität in: • Krankheitsätiologie and Pathogenese • Wirkstoff - Target Interaktionen • Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen • Wirkstoffmetabolismus http://www.ornl.gov/hgmis/medicine/pharma.html

Pharmakologie: Entwicklung und Bereitstellung von Wirkstoffen, die es ermöglichen gesund zu werden oder zu bleiben. Wirkstoffe für bestimmte Gruppen von Individuen entwickeln und anwenden; Verlangt die Zuordnung von Individuen zu diesen Gruppen. Lösung: Pharmakogenomik!? Pharmakologie zu Pharmakogenomik Probleme: • Wirkstoffentwicklung ist teuer • Rationale Wirkstoffentwicklung ist schwierig • Wirkstoffe werden für “Durchschnittsbürger”entwickelt • 10 - 70% non-responders • ~ 100.000 Todesfälle in den USA pro Jahr • Frauen • Kinder

Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung • Ziele: • Verständnis von Krankheitsmechanismen  Drug Targets • Biomarker • Marker für Toxizität und Wirksamkeit • Marker für Differentielle Diagnostik •  Unterstützung von Therapie-Entscheidungen

Grundlagen- & Pharmazeutische Forschung: Biologie & Medizinische Forschung Klinische & Biologische Krankheitsmodelle Identifizierung von Drug Targets Identifizierung von „Krankheitsgenen“ & -mechanismen Präklinische Forschung: Wirkstoff-Screening & Kandidaten-Identifikation in vitro Validierung in vivo Validierung Toxikologische Analyse Klinische Studien: Phase I Phase II Phase III Phase IV Sicherheit, Wirksamkeit, Dosisfindung Individualisierte Medizin Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung

Alle Erkrankungen beruhen zumindest teilweise auf Veranlagung … Umwelteinflüsse Erbanlagen Diabetes Asthma Rheumatoide Arthritis Infektionskrankheiten ... Lungenkrebs Motorradunfall Knochenbrüche Hämophilie Down-Syndrom HFI Rationale für Pharmakogenomik

Spielen Genetische Ursachen eine Rolle? • Zwillings und Geschwisterstudien • Genomweite Kartierungsstudien • Mechanistische Studien • Kandidaten-Gen Assoziationsstudien • Tiermodelle • Zur Identifizierung von: • Im Krankheitsgeschehen implizierten biologischen Prozessen • Wirkstoff Targets • Diagnostischen Markern • Toxikologischen Markern

Zwillingsstudien 3 1 4 2 3 … Einfluss von Umwelt und Genen 4 … Einfluss der Veranlagung 1 … Einfluss der Umweltbedingungen 2 … Einfluss zufälliger Größen Durch den Vergleich der Häufigkeit des Auftretens der Krankheit bei Geschwistern unter verschiedenen Bedingungen lässt sich die Rolle der Veranlagung abschätzen.

Genomweite Kopplungskartierung

Mechanistische Untersuchungen

Komplexe Phänotypen Morphologie Umwelt Proteom Expression: Gene, ncRNA Epigenetik Genetische Variation Kandidatengen-Assoziationsstudien Spielen Varianten eines Gens eine Rolle in einer Erkrankung?

Variable Elemente des Genoms • Chromosomenaberrationen • Mutationen • Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) • Insertionen und Deletionen • Copy Number Variation • Repeats (meist nicht kodierend) • Megasatelliten (mehrere kbp, Blocks bis 100e kbp) • Satelliten (5-171 bp, Blocks 100 kbp bis Mbp) • Minisatelliten (6-64 bp, Blocks 0,1 – 20 kbp) • Microsatelliten (1-4 bp, Blocks bis 150bp) • Repetitive kodierende DNA • “Variable Number Tandem Repeats” (VNTRs) • “Transposable Elements”

ACGTCTATGCATAGCTAG TGCAGATACGTATCGATC ACGTCTATTCATAGCTAG TGCAGATAAGTATCGATC SNPs und Humane Genetische Variabilität • ~ 3 Mrd. Basenpaare • ~ 99.9 % Identität zwischen Individuen • ~ 3 Millionen Basenunter- schiede zwischen Individuen SNP... Single Nucleotide Polymorphism

Clinical Problem Clinical Study Analysis & Gene Selection Clinical-Biological System Candidate Genes Candidate SNPs SNP Evaluationand Selection SNP Short List Assay Design & Genotyping Clinical Data Genotype Data Diagnostics Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Verification Studies Personalized Medicine Verification Studies Drug Targets Research into Causations Aufbau Genetischer Assoziationsstudien SNP Retrieval

Identifizierung von Kandidatengenen Funktionelle Biologie/Biochemie Genetische Kartierung Proteomik “Krankheits Loci” Genfunktion Kandidatengene Genexpression Studien in Tiermodellen

Datenbanken mit Information zu Gen-Eigenschaften

Umfassende (automatisierte) Literatur Analyse

Clinical Problem Clinical Study Analysis & Gene Selection Clinical-Biological System Candidate Genes SNP Retrieval Candidate SNPs SNP Evaluationand Selection SNP Short List Assay Design & Genotyping Clinical Data Genotype Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Aufbau Genetischer Assoziationsstudien

Identifizierung, Bewertung und Auswahl von SNPs • Ausgewählte SNPs sollten: • Die häufigsten Varianten eines Gens detektieren • Mit hoher Wahrscheinlichkeit Einfluss auf die Funktion des Genproduktes haben

SNPs zur Detektion Wichtiger Genvarianten Die Haplotyp-Struktur des Genoms: Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2004 Aug 5

Genotypisierungsmethoden • Sequenzierung • Minisequenzierung • Pyrosequenzierung • Single Base Extension (SBE) • TaqMan • Invader • MLPA • Hoch- und niedrigdichte Oligo-DNA Hybridiserungsarrays Allelspezifische Primerextension Allelspezifische Enzymreaktion Allelspezifische Hybridisierung • Die verschiedenen Detektionsmethoden basieren vor allem auf: • Fluoreszenz • Massenspektrometrie • Chemolumineszenz • Fluoreszenzpolarisation

Genotypisierung - Single Base Extension C G T Biotin A ddNTPs SBE primer Single base Extension PCR product G G Product Purification SBE primer UV Streptavidin Photocleavage SBE primer +G MALDI-TOF MS

Daten Analyse – Wie sehen die Daten aus? Klinische Daten Genetische Daten

Analyse Einzelner Polymorphismen • Vergleich von Allelfrequenzen mit Chi-Quadrat Analyse • Vergleich von Genotypfrequenzen mit Chi-Quadrat • Test auf Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) • Vererbung berücksichtigende Tests • Transmission Disequilibrium Tests (TDT) • Affected Family Based Controls (AFBAC) • Genetisches Relatives Risiko (GRR) • ...

Musteranalysen “Clinical Bar Codes” “Genetic Bar Codes” Patient 1 Patient 2 Patient 3 • Schrittweise Progressive Regression • Klassifikation (Support Vector Machines, Neuronale Netze) • Mustererkennung

Herausforderungen bei der Analyseder Genetik Polygener Phänotypen • Phänotyp-Bestimmung • Sehr geringe Penetranz einzelner Genvarianten (Common Disease – Common Variant vs. Common Disease – Rare Variant ) • Geringe Penetranz von Haplotypen • Genomweite Variantenmuster (GVPs) • GVP-Subgruppen für einen Phänotyp • Erreichen genomweiter statistischer Signifikanz

Genomweite Studien

Bekannte Assoziationen

Pharmakogenetischer Test • Warfarin • “Blutverdünner” z.Bsp. bei Schlaganfallrisiko • Stärkere Reaktion bei ca. 1/3 der Patienten • 25 % Varianten im Vitamin K Epoxidreduktase Komplex 1 Gen (VKORC1) • 10 % Varianten im Cytochrom P450 (CYP2P9) • Ca. 2 Mill neue Patienten pro Jahr • Individuelle Anpassung der Dosierung durch “Trial & Error” • Alter • Gewicht • Ernährung • Medikamente • Genetik • FDA: genetische Tests könnten • Pro Jahr 85.000 Blutungsereignisse verhindern • Pro Jahr 17.000 Schlaganfälle verhindern • Am 17.09.2007 durch die FDA in den USA zugelassen

Phänotyp - Genotyp Analyseder Rheumatoiden Arthritis • Autoimmunerkrankung: Progressive Gelenkzerstörung • Etwa 1% der Bevölkerung betroffen • Lebenserwartung um 5 - 10 Jahre reduziert • Ätiologie nicht genau bekannt • Genetische Suszeptibilität 30-60%

Warum sollte die RA-Genetik untersucht werden? Verständnis der biologischen Prozesse in Ätiologie und Pathogenese  Neue Behandlungsstrategien Frühdiagnose  Therapieentscheidungen Differentialdiagnose Voraussage der Progression

genetic predisposition other risk factors unknown antigens Activation Adhesion Permeabilization T-cells & B-cell activation Migration of inflammatory cells Cytokines Mediators Pannus formation Synovial membrane TNF Production of Collagenases (MMPs) by fibroblasts, chondrocytes and osteoclasts IL-1 Lining cells Joint destruction T-cells, M Dinarello C.A., Moldawer L.L. Amgen 1999, Proinflammatory and Anti-inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis; with Modifications by Ulrich Sack Rheumatoid Arthritis - Etiology and Pathogenesis

IL5R CCR5 CD8A IL18R1 CTLA4 Il2 IL6R PRG4 PRL IL6 HLA HSPA1L; LTA; LTB, MICA CRH CSF2;Il4; Il5; Il13; IRF1 Kopplungs-Loci und Kandidatengene in RA Linkage Likely Linkage Possible No linkage

Unsere Bisherigen Resultate • Suszeptibilitätsanalyse rheumatoide Arthritis: • ~180 SNPs in ~50 Kandidatengenen • Genotypisierung in 500 Proben  >90.000 Genotypen • Kapazität: ~3000 Genotypen pro Tag • >98% erfolgreiche Genotypisierung • <0.1% falsche Bestimmungen (PedCheck) •  mehrere mögliche Assoziationen einzelner SNPs •  einige Assoziationen konnten bestätigt werden • Geninteraktionsanalyse läuft

Genotypisierung - TaqMan

Genotypisierung - Weitere Techniken … Invader Assay Pyrosequencing www.twt.com www.pyrosequencing.com

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