1 / 34

Аналитическое ультрацентрифугирование

Аналитическое ультрацентрифугирование 1913. A. Думанский предложил использовать ультрацентрифугирование для определения размеров коллоидальных частиц.

dalton
Download Presentation

Аналитическое ультрацентрифугирование

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Аналитическое ультрацентрифугирование 1913. A. Думанскийпредложил использовать ультрацентрифугирование для определения размеров коллоидальных частиц. 1923.T.Сведберг и Д. Николссконструировали первуюультрацентрифугу, содержащую оптическую систему для анализа частиц в поле ультрацентрифуги. Годом позже Сведберг наблюдал уменьшение поглощения у вершины центрифужнойкюветы для раствора гемоглобина. В 1926 Сведберг провел первое измерение молекулярных весов гемоглобинаи овальбумина методом седиментационного равновесия, а в 1927году он определил молекулярный вес гемоглобина сочетанием методов седиментации и диффузии. Сведберг пришел к пророческому выводу, что белки представляют макромолекулы, состоящие из большого числа атомов, соединенных ковалентными связями. Золотые годы ультрацентрифуги (1960-1980) Забвение (1980-1995), Возрождение (1995- 2005)

  2. Роторы ультрацентрифуги Ротор в аналитической ультрацентрифуге способен вращаться при скоростях до 50 000 об/мин. Он должен выдерживать большие гравитационные напряжения. Так при скорости 60 000 об/мин гравитационное поле ультрацентрифуги достигает 300 000g. При этих условиях масса 1 г имеет кажущийся вес 300 кг.

  3. Кюветы ультрацентрифуги 1. Одно-секториальная ячейка 2. Би-секториальная ячейка. 3. Би-секториальная ячейка с наслаи- ванием или границе-образующая ячейка Наслаиваемый растворитель

  4. Оптические системы регистрации в ультрацентрифуге Оптика поглощения Интерферометрическая Шлирен- оптика оптика

  5. Два типа экспериментов в ультрацентрифуге

  6. Два типа экспериментов в ультрацентрифуге

  7. Уравнение Ламма Уравнение Ламма описывает процессы транспорта в ультрацентрифуге. Оно получается введением дополнительного члена в первое уравнение Фика. Jx = –D[dC/dx] + uC(x) посколькуu = sω2x Jx = –D[dC/dx] + sω2xC(x) Диффузионый и седиментационный вклады Идеальный процесс Процесс в ультрацентрифуге (dC/dt)r = –1/r {d/dr [ω2r2s C – Dr (dc/dr)t]}t Уравнение Ламма не имеет аналитического решения!!!!

  8. Определение коэффициента седиментации из профиля движущейся границы. Рутинная мода: s and Dчетко определены. Скорость движущейся границы определяется скоростью изменения ее радиальной координаты во времениdrb/dt. u = drb/dt = ω2rs После интегрирования ln rb(t)/rb(t0) = ω2s(t-t0) Наклонln rb(t)/rb(t0)против (t-t0) дает ω2sи, следовательно,s

  9. Уравнение Ламма Метод “средней точки” Вклад седиментации сравним с вкладом диффузии(M< 100 кДа) Вклад седиментации намного больше вклада диффузии ( M> 500 кДа)

  10. Решение уравнения Ламма при различных граничных условиях

  11. Fc + Fb + Fd = 0 mω2r (1 – ρ0 ) = fu s ≡ u/ω2r = M (1 – ρ0)/NA f Отношение скорости частицы к ее центрифужному ускорению называется константой седиментации, s.Ее размерность секунда. s = 2S

  12. Реальные седиментограммы белков и их смесей поглощение [OE] -10 1 поглощение [OE] -1 0 1 поглощение [OE] -1 0 1 -1 0 1 поглощение [OЕ]

  13. Реальные седиментограммы белков и их смесей Белок в изолированном состоянии Белок в изолированном состоянии в буфере + глицерин поглощение [OE] -10 1 поглощение [OE] -1 0 1 Бычий сывороточный альбумин Бычий сывороточный альбумин + глицерин Смесь трех белков Смесь двух белков поглощение [OE] -1 0 1 -1 0 1 поглощение [OЕ] карбонгидраза + бычий сывороточный альбумин Aпо-цитохром с + карбонгидраза + бычий сывороточный альбумин

  14. Численные решение уравнения Ламма для полидисперсных систем (dC/dt)r = –1/r {d/dr [ω2r2s C – Dr (dc/dr)t]}t Решение такого уравнения относится к числу некорректно поставленных задач. Программа SEDFIT (P. Shuck) Проблема устойчивости: Добавление стабилизирующего (регуляризационного) члена Наложение физически разумных ограничений на решение Проблема однозначности (вычисление молекулярной массы): Фиксированные параметры: парциальный удельный объем, плотность растворителя Подгоночные параметр: f

  15. Изолированный БСА (М=66.4 кДа) Смесь БСА (66.4 кДа) и карбоангидразы (М= 30 кДа) Смесь БСА (66.4 кДа), карбоангидразы (М = 30 кДа) и апоцитохрома(М = 13.8 кДа)

  16. Седиментограмма смеси двух белков, состоящей из сывороточного альбумина (M=66.3 КДa) и овальбумина. (M=42.7). Отношение молекулярных масс двух белков равно 1.55 Программа SEDFIT позволяет разрешать белки в смеси, отличающиеся по молекулярной массе не менее, чем в два раза.

  17. 30S M=0.9 106Да 50S M=1.5 106Да

  18. Анализ очень гетерогенных систем Для анализа таких систем используется переменная скорость вращения ротора. Speed Time at s* (at 6.5 cm) (rpm) each speed (s) (svedbergs) ------------------------------------------- 0-6000 15 ~500.000 6.000 600 4220 9.000 600 1300 13.000 600 550 18.000 600 250 25.000 600 125 35.000 600 62 50.000 3600 31 50.000 3600 7.6 50.000 3600 4.4 50.000 3600 3.0 50.000 3600 2.3 Профиль констант седиментации для Limulus polyphemusгемоцианинового раствора (2мг/мл). Ротор фиксировался на скоростях 12, 18, 25, 35, and 50 тысячах об/мин в течение ~20 мин, исключаясамую высокую скорость. (Stafford and Braswell 2004).

  19. Седиментационные коэффициенты биологических макромолекул Коэффициенты седиментациибиологических макромолекулочень малы. За единицу седиментации принята 1×10–13 сек. В честь Теодора Сведберга он называется 1S . Седиментационные коэффициенты биологических макромолекулизмеряются при разных условиях (температура, ионные и солевые условия) и приводятся к так называемым стандартным условиям ( вода и 20 градусов Цельсия) . где s20,w - седиментационный коэффициент приведенный к стандартным условиямi, sexp - экспериментально измеренный, ηexp– вязкость растворителя при экспериментально измеренной температуре, T(oC), η20,w– вязкость воды при 20oC, ρ20,w– плотность воды при 20oC,ρexp– плотность растворителя при данной температуре T(oC) –парциальный удельный объем молекулы..

  20. Молекулярная масса из седиментационных и диффузионных данных s ≡ u/ω2r = M (1– ρ0)/NA f D = RT/f s/D = M(1 – ρ0)/RT M = s /D RT /(1 – ρ0) Первое уравнение Сведберга (fD=fs)? Пример вычисления молекулярной массы: A macromolecule with = 0.74 cm3/g is sedimented in H2O at 20oC; sedimentation coefficient so20w is 14.2 S, diffusion coefficient Do20w = 5.82 x 10-7 cm2/s. Calculate molecular mass.

  21. Молекулярные массы M, константы седиментации, s20,w, и парциальные удельные объемы ΰ биологических макромолекул, начиная от маленьких пептидов (пептид I, 2 kDa) и заканчивая большими олигомерными белками (гемоцианин, 9 MDa).

  22. Форма макромолекул из седиментационных данных s ≡ u/ω2r = M (1– ρ0)/NAf f0= 6π η0(3M/4π NA)1/3 S20w 1/3 /(1 – ρ0) = M 2/3/6π η0 NA2/3(3/4π)1/3 s ~ M2/3 ?

  23. Гомологичная серия гауссовых клубков: белки в 6М гуанидингидрохлориде или в 8М мочевине 0.47 s0/(1 - ρ) = 0.286 n 0.47

  24. ДНК: отжесткой палочки к гауссовому клубку Клубок Палочка s=KsM0.440 (5.4 кbp -170 кbp) s=KsM0.273 (200 kbp-5.4 кbp) Сравнительное гидродинамическое поведение ряда глобулярных белков и небольших фрагментов ДНК.

  25. Рибосомные РНК и их фрагменты Фрагменты Нативные большие рибосомные РНК 0.47 Нативные малые рибосомные РНК

  26. Рибосомные частицы иРНК-белковые комплексы 2/3 Три домена 16S РНК окрашены разным цветом Сравнение гидродинамических характеристик РНК-белковых комплексов, моделирующих три основных домена в 30S рибосомной частице, и 30S рибосомной частицы с отрезанной “головой“. “Безголовая” 30S

  27. Седиментационное равновесие . (dC/dt)r = –1/r{d/dr[ω2r2sC – Dr(dc/dr)t]}t = 0 и следовательно D(dC/dr)t – ω2rCs = 0 d ln(C)/d(r2/2) = 1/rC dC/dr ω2s/D = M(1 – ρ)ω2/RT Тогда распределение молекул от мениска aдо точкиrбудет подчиняться экспоненциальному закону: C(r) =C(a) exp{ω2M(1 – ΰρ0) (r2 – a2)/2RT}, а зависимостьln [C(r)] от r2/2будет иметь вид:

  28. Зависимостьln [C(r)] от r2/2 или x2 представленана рисунке для монодисперсного раствора (а) и полидисперсного раствора (b). Средняя молекулярная масса основана усреднении числа или массы разных компонентов в растворе. Так, если складывается число разных компонент ni, то такая молекулярная масса называется среднечисленной,Mn, и определяется как Mn = ∑Nimi/∑Ni== ∑nimi Если складываются веса разных компонент mi, то такая масса называется средневесоваой, Mw, и определяется как, Mw = ∑Nim2i/∑Nimi=∑wimi Пример для смеси двух молекул с массами 10,000 Da and 100,000 Дa Mn= 55,000 Дa, тогда как Mw= 91 818 Дa

  29. Парциальный удельный объем Парциальный удельный объем молекулы есть изменение объема раствора при внесении в него одной молекулы вещества dV/dC = Он может быть >0, = 0 или <0 (Mg SO4) На опыте он может быть определен путем серии измерений плотности растворов, содержащих разную весовую долю молекул w где, ρ and ρ0 - плотности раствора и растворителя, соответственно. 1) Размерность парциального удельного объема см3/г. 2) Парциальный удельный объем молекулы не зависит от объема, занимаемого ею в растворе. Парциальный удельный объем белка мало меняется при денатурации.

  30. Расчет величин парциальных удельных обьемов биологических макромолекул Парциальные удельные обьемы и молекулярные массы аминокислот М ύ (см3/г) Glycine 57 0.64 Alanine 71 0.74 Serine 87 0.63 Threonine 101 0.70 Valine 99 0.86 Leucine 113 0.90 Isoleucine 113 0.90 Proline 97 0.76 Methionine 131 0.75 Phenylalanine 147 0.77 Cystine 103 0.61 Tryptophan 186 0.74 Tyrosine 163 0.71 Histidine 137 0.67 Arginine 156 0.70 Lysine 128 0.82 Aspartic acid 115 0.60 Glutamic acid 129 0.66 Glutamine 128 0.67 Asparagine 115 0.60 Парциальные удельные обьемы и молекулярные массысахаров М (см3/г) Fructose 180 0.614 Fucose 164 0.671 Galactose 180 0.622 Glucose 180 0.622 Hexose 180 0.613 Sucrose (0.05 M) 342 0.613 Sucrose (0.15 M) 342 0.616 Sucrose (1 M) 342 0.620 Raffinose (25oC) 486 0.608 Средние величины парциальных удельных обьемов четырех типов биологических макромолекул (cm3/г) Proteins 0.73 (0.70-0.75) Carbohydrates 0.61 (0.59-0.65) RNA 0.54 (0.47-0.55) DNA 0.57 (0.55-0.59) Рибосома!! ΰ1.2-= ύ1м1/(м1+м2) + ΰ1м2/(м1+м2)

  31. Парциальный удельный объем белка может быть рассчитан из парциальных удельных объемов составляющих его аминокислотных остатков по аддитивной формуле (Cohn and Edsall, 1943) ύ= ∑iύWi / ∑i Wi где Wi весовая доля, аύiпарциальный удельный объем ithостатка. Парциальный удельный объем белка в настоящее время вычисляется по его химическому составу с помощью программы SEDNTEP (Harpaz et al., 1994)

  32. Седиментация в градиенте плотности Равновесная седиментация в градиенте плотности CsCl Скоростная седиментация в градиенте плотности сахарозы Опыты Месселсона-Сталя по доказательству полуконсервативного механизма редупликации ДНК

  33. Опыты Месселсона-Сталя по механизму редупликации ДНК Рассуждение Эксперимент Эксперимент Клетки E. coliпараллельно выращиваются на среде, содержащей легкий и тяжелый изотопы азота14N и15 N. Затем клетки, выращенные на одной из сред, переносятся на другие среды. Выделенная из клеток ДНК анализируется методом равновесной седиментации в градиенте плотности

More Related