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荧光蛋白标记亚细胞定位

荧光蛋白标记亚细胞定位. 扬州大学 生物科学与技术学院. 问题的提出. 一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物理状态. 但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白，以利用了解以下信息. 1. 目的蛋白定位在什么地方 ?. 2. 目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用. 这些问题能够通过以下实验揭示. (1) 蛋白荧光细胞定位. (2) 酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移. 荧光蛋白标记细胞定位.

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荧光蛋白标记亚细胞定位

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Presentation Transcript

  1. 荧光蛋白标记亚细胞定位 扬州大学 生物科学与技术学院

  2. 问题的提出 一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物理状态 但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白，以利用了解以下信息 1. 目的蛋白定位在什么地方? 2. 目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用 这些问题能够通过以下实验揭示 (1) 蛋白荧光细胞定位 (2) 酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移

  3. 荧光蛋白标记细胞定位 将目的基因与绿色荧光蛋白基因（EGFP）融合，通过绿色荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行亚细胞定位 限制性内切酶位点 终止子 目的蛋白基因 启动子 P Target Linker (poly-G) P EGFP Target

  4. 荧光亚细胞定位的设备: 激光共聚焦显微镜 激光共聚焦显微镜所发射的光能聚焦在样品的一个非常薄的切面上。 激光共聚焦显微镜的优点是其能剔除非焦平面来源的任意光线。

  5. 实验方法 • 克隆目的基因的开发阅读框 • 将目的基因与EGFP基因融合（在哺乳动物细胞中，一般选用pEGFP系列质粒载体） • 将质粒转染细胞 • 在不同的时间点在激光共聚焦显微镜下观察EGFP在细胞中的定位，如有必要需进行亚细胞组分的染色，例如细胞核染色（一般可用PI, DAPI或Hochist);内质网染色或线粒体染色。

  6. 荧光亚细胞定位的应用 荧光是最常用的工具用于蛋白的亚细胞定位 Actin endoG-YFP (apoptotic endonuclease) Mitochondria Debrin Colocalization Apoptosis 12 (7): 1155-1171, 2007

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