福建南部養殖石斑魚爆發性疾病流行調查

1. 福建農林大學學報 (自然科學版) 第 35 卷, 第 5 期, 2006 年 9 月 福建南部養殖石斑魚爆發性疾病流行調查 冀艷清, 陳信忠, 王軍, 蘇雅玲, 俞秀霞, 黃麗莎, 蘇永全 指導教授：古鎮鈞 學生：王茂麟 學號：1092407027

2. 前言 • 石斑魚 (Epinephelus sp.) 是海水養殖的高經濟魚種之一，在國內外市場供不應求，而在日本、中東、東南亞國家以及中國大陸、台灣、香港地區亦同，尤其是為華人、華裔社區所歡迎。

3. 脊索動物亞門　Subphylum Vertebrata條鰭魚綱　Actinopterygii　新鰭亞綱　Neopterygii　　鱸形目　Perciformes　　　鱸亞目　Percoidei　　 　　鮨科　Serranidae　　　　石斑魚屬　Epinephelus 摘自：台灣魚類資料庫

4. 香港地區從 70 年代開始人工箱網養殖，80 年代起，菲律賓、泰國、印尼以及廣東、福建、浙江和台灣等地區也開始大規模的箱網養殖。 • 近年來在台灣養殖的石斑魚常常爆發急性傳染病造成大規模死亡，已知的致病原大多為神經壞死病毒 (nervous necrosis virus; NNV)。

5. 在福建、廣東、海南島等主要石斑魚養殖區，近年來也常常發生急性傳染病，其病原包括多種細菌和 NNV。 • 在福建南部地區，每年夏、秋高溫季節爆發的各種急性傳染病常常造成大批石斑魚發病死亡，一些石斑魚育苗場也常因急性傳染病導致大量魚苗死亡，造成養殖戶的巨大經濟損失。

6. 由於大部分養殖場缺乏病原檢測技術，難以了解引發傳染病的致病原。由於大部分養殖場缺乏病原檢測技術，難以了解引發傳染病的致病原。 • 展開養殖石斑魚的爆發性病害之流行病學調查，闡明其主要致病原，進而制定有效的防治措施已成為石斑魚養殖業迫切需要解決的課題。

7. 材料與方法 • 材料 • 細菌分離鑑定 • 病毒性病原檢測 • 寄生蟲病原檢查 • 水質監測 • 組織病理學觀察

8. 材料 在福建廈門、東山、漳浦等石斑魚養殖和育苗場選擇 數個養殖場。 對各種病害的發生和危害進行記錄與監測。 在石斑魚發病季節，深入箱網養殖現場，調查瞭解病情 、臨床症狀以及季節消長變化，並採集病魚帶回實驗室 進行病原學檢測。

9. 漳浦 廈門 東山

10. 用於組織切片的病魚採自福建漳浦某石斑魚育苗場，用於組織切片的病魚採自福建漳浦某石斑魚育苗場， 病魚具有典型的病毒性神經壞死症狀。 試驗用的引子、DNA 萃取試劑、RNA 萃取試劑、Taq 酶、 M-MuLV 反轉錄酶、RNA 病毒抑制劑、dNTP 等由上海生 工生物工程技術服務有限公司提供。 ABI 9700 PCR 儀為 PE 公司產品；自動微生物檢測儀 VITER JK 和 GNI 鑑定卡由法國生物梅里埃公司生產； 細菌微量生化鑑定管由北京陸橋醫學生物技術中心生產。

11. 細菌分離鑑定 針對病魚的肝臟及體表潰爛部位。 以常規方法分離病原菌。 以自動微生物檢測儀進行鑑定。

12. 病毒性病原檢測 取病魚的腦和視網膜。 應用 RT-PCR 方法檢測 NNV (陳等，2004)，反向引子 為：5’ - CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA -3’， 正向引子為：5’ - CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT-3’，用於擴增 NNV RNA2 基因組的 421 bp 特異性 片段。

13. 以 PCR 方法檢測真鯛虹彩病毒 (red sea bream iridovirus , RSIV)，上游引子為：5’ –CGG GGG GAA TGA CGA CTA CA – 3’，下游引子為：5’ –CCG CCT GTC CCT TTT CTG GA – 3’ 用於擴增 RSIV基因組的 568 bp 特異性片段。

14. RT-PCR • 簡言之，PCR 是以 DNA 為模板，對目標 DNA 片段進行大量複製的技術。 • 不以 RNA 作為模版，是因為 RNA 太不穩定，並且由於 RNase 之存在，使 RNA 極易受破壞，而解決的方式，即是將 RNA 轉為 DNA。 • RT-PCR 即是將 mRNA 反轉錄為 cDNA 的方法。

15. 寄生蟲病原檢查 現場檢查石斑魚體表皮膚、鰓等寄生蟲感染情況。 採集病魚帶回實驗室解剖，檢查體表與體內的寄生蟲。

16. 水質監測 現場監測並紀錄養殖水體的水溫、鹽度、pH、溶氧量等 水質參數，觀察水質變化情況。

17. 組織病理學檢查 活體解剖取石斑魚的腦、眼、肝、心、脾、腸、鰓等 組織。 以 Davidson 氏固定液固定。 進行脫水、包埋、切片。 蘇木紫 & 伊紅 (H&E) 染色。

18. 製成永久封片。 觀察組織病理變化。

19. Davidson 氏固定液 • 1 L 的配方為：酒精 330 ml、福馬林 220 ml、冰醋酸 115 ml、蒸餾水 335 ml，常用於病理組織標本之固定。 • 浸泡時容器中固定液不可超過 7 分滿，在組織加入後的 30-60 分鐘要儘可能搖晃，使固定液滲入組織。 • 需保存於低溫中。

20. 結果與分析 • 病害流行基本情況 • 病毒性病原 • 細菌性病原 • 寄生蟲病原 • 水質監測情況

21. 病毒流行基本情況 • 近幾年福建南部地區箱網養殖的石斑魚爆發急性傳染病具有明顯的季節性。 • 每年四月下旬開始出現傳染病情，隨後廈門地區的各個石斑魚養殖場均發現該病流行。 • 幼魚與成魚發病情況基本上是相同的。

22. 發病初期死亡之病魚，外觀無明顯臨床病變，厭食、腹部朝上、漂游於水面，螺旋狀或旋轉游動，反應遲鈍，部分病魚腹部明顯膨大。發病初期死亡之病魚，外觀無明顯臨床病變，厭食、腹部朝上、漂游於水面，螺旋狀或旋轉游動，反應遲鈍，部分病魚腹部明顯膨大。 • 解剖檢查病魚，可見肝色澤變淺呈土黃色，脾呈暗紅色，鳔充血、膨大，腎壞死、糜爛，腦表層發紅。

23. 魚腦構造 • 嗅葉 • 大腦 • 小腦 • 中腦 • 延髓 • 脊髓 http://homepage.ntu.edu.tw/~b92b01079/

24. 發病後期，病魚消瘦，頭大體小，部分病魚的背鰭、尾鰭輕微充血，下頜部分常出現紅腫、潰爛，部分病魚身體其他部位也出現魚鱗脫落、潰爛等病原混合感染的症狀，多在發病後十多天衰竭死亡。發病後期，病魚消瘦，頭大體小，部分病魚的背鰭、尾鰭輕微充血，下頜部分常出現紅腫、潰爛，部分病魚身體其他部位也出現魚鱗脫落、潰爛等病原混合感染的症狀，多在發病後十多天衰竭死亡。

25. 發病季節水溫約 18-26 ℃，鹽度 25-31 ppt，pH 7.8-8.2。 • 在陰天，溶氧量低於 4 ppm 時，發病魚和死亡魚數量明顯增加。 • 6 月中旬，水溫上升至 28 ℃以上，病情有所緩解，死亡數也明顯減少。

26. 疾病流行期間各種石斑魚均有發病，但病情最為嚴重的是赤點石斑魚 (E. akaara)，其次是青石斑魚 (E. awoara) 和斜帶石斑魚 (E. coioides)。 Epinephelus coioides Epinephelus akaara Epinephelus awoara 摘自：台灣魚類資料庫

27. 上述種類在當年投放的幼魚死亡率較高，累積死亡率可達 70-90%。 • 2 齡以上的成魚也有發病，每個箱網每天死亡數十尾至上百尾，持續 1 個多月，總死亡率達 20-40%。

28. 人工繁殖的石斑魚魚苗，不同種類的發病時間及年齡有明顯差異。人工繁殖的石斑魚魚苗，不同種類的發病時間及年齡有明顯差異。 • 鞍帶石斑魚 (E. lanceolatus) 魚苗發病多在春節前後，發病水溫約 20-25 ℃，發病魚體長多在 4 cm 以上。 • 青石斑魚 (E. awoara) 的魚苗在孵化後數天即可發病，死亡率可達 100 %。

29. 發病初期死亡的魚苗無明顯的外觀臨床病變，病魚表現厭食，出現旋轉狀游動，或靜止時腹部朝上，部分個體鳔腫大，活動性和群聚性差，側臥於池底或不正常游動。發病初期死亡的魚苗無明顯的外觀臨床病變，病魚表現厭食，出現旋轉狀游動，或靜止時腹部朝上，部分個體鳔腫大，活動性和群聚性差，側臥於池底或不正常游動。 • 解剖可見病魚腦部稍有紅腫，肝色澤變淺或正常，其他器官無明顯病變。

30. 發病後期，病魚消瘦乏力，體表尤其是尾鰭和下頜常出現紅腫、潰爛，病魚衰竭死亡。發病後期，病魚消瘦乏力，體表尤其是尾鰭和下頜常出現紅腫、潰爛，病魚衰竭死亡。

31. 病毒性病原 • 自 2003 年 2 月至 2004 年 10 月，共檢測各種石斑魚 40 多批近 200 份樣品，NNV 的陽性率為 60-100%，平均陽性率約為 80 % • 對於箱網養殖的石斑魚，在發病高峰季節的 4-7 月份陽性率很高，而冬春季檢測陽性率較低。

32. 在室內育苗池，剛孵化的仔魚和魚苗一旦出現臨床症狀，NNV 的感染率均可達 100%；另外從青石班魚的魚卵以及孵化 2-3 days 的仔魚中多次驗出 NNV。 • 來自同一批親魚的魚卵育出的魚苗連續兩年爆發同樣症狀的急性傳染病造成大量魚苗死亡，NNV 檢測均呈現陽性結果。

33. 圖1 為青石斑魚 NNV 檢查結果，在 421 bp 附近均出現明顯亮帶，代表 NNV 為陽性。 • 同時也對該樣品進行 RSIV 檢測，結果全部顯示陰性。

34. 另對多批石斑魚病魚的各種組織進行組織病理學觀察，其主要病變出現在腦和視網膜，其他組織的病理損傷較少或不明顯 (圖 2)。

35. 另對多批石斑魚病魚的各種組織進行組織病理學觀察，其主要病變出現在腦和視網膜，其他組織的病理損傷較少或不明顯。另對多批石斑魚病魚的各種組織進行組織病理學觀察，其主要病變出現在腦和視網膜，其他組織的病理損傷較少或不明顯。

36. 最典型的病理變化是中樞神經系統和視網膜組織空泡化和壞死，在視網膜的視細胞層也可觀察到空泡壞死病變，但相對較少 (圖2 A、B)。 圖 2 A、B. 視網膜組織病變 (a 為色素層及其空泡病變；b 為視細胞層的空泡壞死病變，c 為雙極細胞層)。

37. 魚類之正常及病理組織學 視網膜結構

38. 中樞神經系統的脊神經和各種腦組織中也有大量的空泡和壞死 (圖2 C、D)。 圖 2 C、D. 腦組織空細胞壞死 (箭頭標示空泡壞死病變)。

39. 肝組織有大面積淤血和壞死病變，肝細胞空泡化，細胞核嚴重萎縮被擠向一側 (圖2E、F)。 圖 2 E、F. 肝組織病變及空泡壞死 (n 為淤血病變，h 為空泡病變，箭頭表示肝細胞核萎縮病變)。

40. 在這些切片中還可見其他組織損傷，如受感染細胞核固縮，細胞失水，嗜鹼性；神經細胞核固縮、裂解，神經纖維突顆粒狀，單核細胞滲漏。在這些切片中還可見其他組織損傷，如受感染細胞核固縮，細胞失水，嗜鹼性；神經細胞核固縮、裂解，神經纖維突顆粒狀，單核細胞滲漏。 • 上述特徵與 NNV 引起的病毒性神經壞死病病理特徵相符合，同樣說明 NNV 是福建南部沿海石斑魚爆發性傳染病的主要致病原。

41. 細菌性病原 • 2002 年 3 月至 2004 年 10 月，先後從廈門、漳浦、東山等地的各種發病石斑魚中共分離到 10 種細菌。 • 以自動微生物檢測系統 (AMS) 以及其附加的生化反應鑑定結果見表 1。

43. 最常見的細菌是溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)、副溶血性弧菌 (V. parahaemolyticus) 和河流弧菌 (V. fluvialis)，其餘幾種細菌較為罕見。 • 這些細菌多出現在病魚的潰瘍或潰爛部位，在體表正常的病魚也能分離出部分上述細菌。

44. 用上述 3 種常見細菌對鞍帶石斑魚苗進行人工感染試驗表明，這些細菌單獨注射感染不會引發魚苗發病死亡。 • 大量檢測試驗還表示，這些細菌在養殖水體中長年均可出現，而且從一些正常的魚體內亦能分離到這些細菌。

45. 寄生蟲病原 • 主要有微孢子蟲、貝尼登吸蟲以及其他寄生蟲之感染。

46. 微孢子蟲病 • 微孢子蟲 (Microsporidians) 病在廈門海區的養殖石斑魚中全年均可發生，但以 4-10 月份檢出率較高。 • 寄主包括各種石斑魚，幼魚和成魚均可感染，但以 1 齡以上的成魚較常見。 • 同養殖場區域或同一箱網的石斑魚常同時感染，但附近的其他魚類很少感染微孢子蟲。

47. 病魚腹部膨大變形，外觀無明顯臨床病變，病魚表現厭食、消瘦、反應遲鈍、體色變黑或變淺。病魚腹部膨大變形，外觀無明顯臨床病變，病魚表現厭食、消瘦、反應遲鈍、體色變黑或變淺。 • 解剖病魚，體腔內寄生有數量不一的微孢子蟲孢囊，大部份孢囊表面呈黑色，圓形或橢圓形，質軟，大小不一，大的直徑可達 6-8 mm，因型似黑豆，又稱”黑豆病“ (圖2 G)。

48. 病魚腹部膨大變形，外觀無明顯臨床病變，病魚表現厭食、消瘦、反應遲鈍、體色變黑或變淺。病魚腹部膨大變形，外觀無明顯臨床病變，病魚表現厭食、消瘦、反應遲鈍、體色變黑或變淺。 • 解剖病魚，體腔內寄生有數量不一的微孢子蟲孢囊，大部份孢囊表面呈黑色，圓形或橢圓形，質軟，大小不一，大的直徑可達 6-8 mm，因型似黑豆，又稱”黑豆病“。 圖2 G. 腹腔內出現大量黑色孢子囊

49. 另有少數孢囊呈現銀灰色，呈多角型，質硬。 • 孢囊多寄生於腹腔腸系膜、生殖腺、肌肉或其他結締組織，也有部分寄生於肝臟等器官，少數游離腹腔。 • 每尾魚感染從數個到數十個不等，最多的孢囊數可達近百個。

50. 組織切片中孢囊囊膜完整，由顆粒層、黑色顆粒層組成。組織切片中孢囊囊膜完整，由顆粒層、黑色顆粒層組成。 • 囊內充滿子孢子，在組織切片中可見其均勻分布，呈圓形或橢圓形 (圖2 H)。