بسم الله الرحمن الرحیم

1. بسم الله الرحمن الرحیم تشخیص با سیل های گرم منفی در عفونت ادرای حمید بهرامی کارشناس ارشد آزمایشگاه

2. تهیه گسترش ورنگ آمیزی باکتری اولین اقدام جهت شناسایی باکتری تهیه ی گسترش و رنگ آمیزی می باشد. بدین منظور ابتدا یک قطره سرم فیزیولوژی استریل بر روی لام (مرکز لام ) قرار داده سپس با یک آنس استریل یک قسمت کوچک از کلونی مورد نظر را برداشته در قطره سرم فیزیولوژی حل نموده بصورت شیرابه در سطح لام به اندازه وضخامت مناسب پخش می نماییم.پس از خشک شدن با کمک حرارت ملایم شعله فیکس نموده ولام آماده برای رنگ آمیزی می باشد.

3. ساخت رنگ گرم روش ساخت کریستال ویوله 20 گرم کریستال ویوله رادر100 میلی لیتر اتانول 95 درصد حل کرده بنام محلول A یک گرم اگزالت آمونیوم رادر100 میلی لیتر آب مقطرحل کرده بنام محلول B محلول A رابه نسبت 1 به 10 رقیق کرده وبا 4 برابر محلول B مخلوط کرده صاف می نمایم روش ساخت لوگول یک گرم یدکریستال ودوگرم یدورپتاسیم راساییده ومخلوط می کنیم وسپس 300 میلی لیتر آب مقطر رابه آرامی به آن اضافه می کنیم روش ساخت محلول بی رنگ کننده 250 میلی لیتر اتانول 95 درصد رابا250 میلی لیتر استون ترکیب کرده ودر شیشه های درب دار نگهداری می کنند . سافرانین (رنگ مخالف) 2/5 گرم سافرانین رابا100 میلی لیتر اتانول 95 درصد مخلوط کرده ودرشیشه های درب دار نگهداری می کنند .

4. روش رنگ آمیزی گرم 1- رنگ کریستال ویوله رابه مدت 30تا45 ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد 2- پس از شستشو گسترش با آب به مدت 30تا45 ثانیه با لوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند . مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت 15 تا20 ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند . 4- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت 30 تا45 ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .

5. گرم منفی گرم مثبت

6. محیط های افتراقی جهت شناسایی باسیل های گرم منفی Triple Sugar Iron Agar(TSI Agar)) این محیط حاوی سه قند گلوکز،لاکتوز و ساکاروز می باشد معرف محیط فنل رد بوده وعلاوه بر آن حاوی سولفات فروز بوده که برای بررسی تولید سولفید هیدروژن استفاده می گردد. برای تفکیک باسیل های روده ای گرم منفی بر اساس تخمیر کربوهیدرات (تغییر رنگ در حضور معرف از قرمز به زرد) وتولید سولفید هیدروژن(سیاه شدن درعمق لوله) به کار میرود. غلظت گلوکز یک دهم (0.1) غلظت لاکتوز یا ساکاروز است. اگر محیط در عمق لوله زرد شود(اسیدی)، اما در سطح شیب دار قرمز شود(قلیایی) ، ارگانیسم گلوکز مثبت می باشد. رنگ زرد در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم مورد نظر گلوکز، لاکتوز و ساکاروز مثبت می باشد. رنگ قرمز در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم تحت بررسی یک غیر تخمیر کننده است. بعضی از میکرو ارگانیسم ها ممکن است در روی محیط کلیگلر آیرون آگار سولفید هیدروژن تولید کنند ولی در محیط سه قندی به دلیل وجود ساکاروز که در بعضی موارد مکانیسم آنزیمی تولید سولفید هیدروژن را مهار می کند ایجاد این گاز را نمی کنند مثل بعضی از سالمونلا ها و انتروباکتریاسه.

7. TSI کنترل کیفی محیط

9. Urea agar این محیط برای جدا سازی با کتری هایی که قادربه استفاده از اوره و تولید آنزیم اوره آز می باشند به کار می رود مانند پروتئوس و به دو صورت پایه آگار و پایه براث تهیه می شوند.

10. کنترل کیفی محیط اوره

12. MR-VP Broth این محیط برای تفکیک باکتری ها براساس واکنش های متیل رد و وژس پروسکوئر به کار می رود .در این محیط با افزودن معرف آلفا نفتول به کشت های میکروبی که قادر به تولید محصول استوئین(استیل متیل کربینول) از تخمیر دکستروز(گلوکز) می باشند در حضور اکسیژن و قلیا اکسید می شود تا دی استیل را تولید کند که با کراتین واکنش می دهد ورنگ قرمز تولید می کند . این واکنش را وژس پروسکوئر مثبت گویند .میکروب های متیل رد مثبت ، مقادیر زیادی اسید در طی تخمیر گلوکز تولید می کنند که بر سیستم بافری فسفات غلبه کرده و به محض افزودن معرف متیل رد رنگ قرمز تولید می کند .

13. ساخت معرف آلفانفتول :A1-محلول5گرم آلفانفتول را در مقدار کمی الکل اتیلیک 95 درجه حل کرده وحجم آنرا بتدریج به 100 میلی لیتر می رسانیم .:B2- محلول 40 گرم هیدروکسید پتاسیم را در 100ملی لیتر آب مقطر حل می کنیم و در یخچال .نگه می داریم برای انجام تست ابتدا 6 قطره از معرف A و 2 قطره ازمعرف B را به لوله اضافه کرده و لوله راتکان می دهیم سپس به مدت 15 دقیقه لوله را بی حرکت قرار می دهیم پیدایش رنگ صورتی متمایل به قرمز نتیجه مثبت را نشان می دهد. .

14. ساخت معرف متیل رد 0.1 گرم از پودر متیل رد را در 300 میلی لیتر الکل اتیلیک 95 درجه حل نموده وسپس 200 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه می کنیم. محلول را در ظرف قهوه ای نگهداری می کنیم . پس از اضافه کردن چند قطره به محیط مورد نظر در صورت مثبت بودن قرمز رنگ می شود.

15. MR-VPکنترل کیفی

17. Sulfide Indol Motility(SIM) این محیط برای جداسازی باسیل های روده ای بر اساس تولید سولفید، اندول و حرکت به کار می رود.این مشخصه ها در شناسایی انتروباکتریاسه مخصوصاٌ سالمونلا وشیگلا کمک می کند .در این محیط تیوسولفات سدیم و سولفات آمونیم فروز معرف های سولفید هیدروژن ،معرف کواکس یا ارلیخ برای اندول که در اثر استفاده از پپتون کازئین که سرشار از تریپتوفان است به وجود می آید استفاده می شود و شناسایی حرکت به علت طبیعت نیمه جامد محیط امکان پذیر است.

18. SIMکنترل کیفی

19. ساخت محلول کواکس یا ارلیخ 2 گرم از پودر پارا دی متیل آمینوبنزآلدئید + 190میلی لیتر اتیل الکل + 40میلی لیتر اسید کلریدریک غلیظ برای آزمایش چند قطره از معرف کواکس را به سطح محیط اضافه می کنیم در صورت مثبت بودن حلقه قرمز رنگ بین محیط ومعرف الکلی ایجاد می گردد.چنانچه نتیجه منفی بود محیط را 24 ساعت دیگر برای بررسی نگه می دارند .

21. Simmons Citrate Agar برای افتراق باکتری های گرم منفی بر اساس مصرف سیترات به کار می رود .ارگانیسم هایی که قادرند آمونیم دی هیدروژن فسفات و سیترات سدیم را به عنوان تنها منابع نیتروژن وکربن مصرف کنند به طور نسبی بر روی این محیط رشد می کنند و واکنش قلیایی تولید می کنند که با تغییر رنگ معرف برم تیمول بلو از سبز(خنثی) به آبی(قلیایی) مشخص می شود.

22. نکات مهم • مقدار خیلی کم از ارگانیسم مورد نظر (کلنی ایزوله ) را در سطح آگار شیب دار سیمون سیترات تلقیح نمایید. فرو بردن سوزن مخصوص کشت، به ته لوله جهت کشت لازم نمی باشد. • ایجاد رنگ آبی نشان دهنده واکنش مثبت است. گاهی ممکن است تغییر رنگ در محیط دیده نشود اما درمسیر خط کشت باکتري، رشد دیده شود که این حالت نیز مثبت در نظر گرفته می شود. بهتر است در این شرایط مجدداً با مقادیر کم باکتري، آزمایش را تکرار نمایید . • مقدار تلقیح باكتري باید به میزان خیلي كم باشد زیرا در غير این صورت تركیبات آلي موجود در دیواره باكتري هاي در حال تخریب، كربن و نیتروژن زیادي آزاد كرده و مي توانند واكنش مثبت كاذب حاصل نمایند.

24. کنترل کیفی سیمون سیترات

25. محیط کشت لیزین(Lysine Iron Agar) این محیط برای تفکیک ارگانیسم های روده‌ای براساس توانایی در دکربوکسیله یا دآمینه کردن لیزین و تشکیل سولفید هیدروژن به کار می‌رود. کشت‌هایی از باسیل‌‌های روده‌ای که سولفید هیدروژن تولید می‌کنند، به علت تولید سولفید فروز باعث سیاه شدن محیط می‌شوند. آنهایی که لایزین دکربوکسیلاز تولید می‌کنند، واکنش قلیایی (ارغوان رنگ) یا واکنش خنثی در عمق محیط ایجاد می‌کنند. ارگانیسم‌هایی که لایزین را در آمینه می‌کنند، باعث قلیایی شدن و گسترش رنگ قرمز در سطح و اسیدی شدن و رنگ زرد در عمق می‌شوند. ممکن است گاز تشکیل شود اما تشکیل آن اغلب نامنظم و بی قاعده است، یا اینکه مهار می‌شود. با استفاده از آنس، با برداشت یک کلنی از یک کشت خالص، عمق را دوبار سوراخ نموده و سپس سطح شیب‌دار را کشت دهید. لوله‌ها را با درپوش‌های شل شده به مدت 24-18 ساعت در دمای 35+2 درجه سانتیگراد در اتمسفر هوازی انکوبه نمائید. قلیایی= رنگ ارغوانی   اسیدی= رنگ زرد   خنثی= رنگ خاکستری مایل به آبی

26. محیط لیزین آیرون آگار دارای اسید آمینه لیزین گلوکز وپپتون است معرف این محیط بروموکروزول ارغوانی است ورنگ اولیه محیط بنفش می باشد . این محیط معمولا بصورت شیب دار و قسمت عمق می باشد . از آنجاییکه که توانایی باکتری در دآمیناسیون در شرایط هوازی وتوانایی باکتری برای دکربوکسیلاسیون درشرایط بیهوازی بررسی می گردد قسمت سطح شیبدار لوله برای واکنش لیزین دآمیناز وقسمت عمق لوله به منظور بررسی واکنش لیزین دکربوکسیلاز مطالعه می شود . باکتری درابتدا با متابولیسم گلوکز باتولید اسید باعث تغییر رنگ محیط به زرد می شود و پس از آن درصورتیکه باکتری قادر به دکربوکسیلاسیون لیزین باشد درعمق لوله آزمایش با جدا کردن بنیان کربوکسیل از اسید آمینه باعث قلیایی شدن محیط و تغییر رنگ آن به بنفش می شود .لذا درصورتیکه رنگ قسمت عمق پس از24ساعت بنفش باشد نشانه توانایی باکتری دردکربوکسیلاسیون لیزین است . درصورتیکه باکتری قادر به دآمیناسیون لیزین باشد درسطح شیبدار لوله آزمایش باجداکردن بنیان آمین از اسید آمینه باعث اسیدی شدن محیط می گردد .این مورد به همراه استفاده باکتری از پپتون درشرایط هوازی و تولید ترکیبات قلیایی باعث تغییر رنگ سطح شیبدار محیط به قرمز آلبالویی می گردد . لذادرصورتیکه رنگ قسمت شیبدار پس از 24ساعت قرمز آلبالویی باشد نشانه توانایی باکتری در دآمیناسیون لیزین است و درصورتیکه باکتری قادر به دآمیناسیون لیزین نباشد سطح شیبدار به رنگ بنفش دیده می شود .

28. تفسیر آزمایش: از آنجا که همه آنتروباکتریاسه ها در نتیجه تخمیر قند گلوکز ،اسید تولید نموده و محیط را به رنگ زرد در می آورند ،محیط به رنگ زرد باقی خواهد ماند، مگر آنکه باکتری اسید آمینه مورد نظر را نیز دکربوکسیله کند. در این صورت قلیائیت حاصله، محیط به رنگ بنفش (قلیایی) در خواهد آمد. نتیجه: رنگ بنفش: مثبت رنگ زرد: منفی 

29. باکتریهای غیر تخمیرکنندهNon fermenter سودوموناس جنس سودوموناس ها با توجه به توانایی بالایی که در برداشت مواد غذایی دارند در بسیاری از محیطها یافت می شوند باکتری های جنس در آب و خاک و فاضلاب و گردو غبار و هوا وجود دارد و در روده ، پوست انسان و حیوانات به طور کومنسال دیده می شود. به طور کلی هرجا که مواد آلی در حال تجزیه باشد این باکتری یافت می شودسودوموناس ها باسیل های گرم منفی مستقیم یا خمیده ، هوازی ، اکثرا متحرک و دارای چند فلاژل در یک قطب یا دو قطب باکتری هستند به جز سودوموناس مالئیmalleiکه بدون حرکت استباکتری های این جنس قادر به تخمیر قندها نیستند اما دارای آنزیم اکسیداز می باشند که به وسیله این تست ها از خانواده آنتروباکتریاسه ها جدا می شوند.

30. این باکتریها به سادگی در محیط های معمولی مثل آگار خوندار و آگار غذایی رشد میکنند و دارای همولیز بتا می باشند و تقریبا در تمام محیط های کشت آزمایشگاهی قابل پرورش و جداسازی هستند.

31. سودوموناس آئروژینوزا عفونت های سوختگی ، انواع زخم ها ، عفونت های گوش ، دستگاه های ادراری و تناسلی ، تنفسی ، همچنین مفاصل و چشم جدا نمود.سودوموناس آئروژینوزا به صورت باسیل های گرم منفی، به صورت تک تک یا دوتایی دیده می شوند. این باکتری متحرک است و به کمک توانایی رشد در حرارت ۴۲ درجه سانتیگراد از سایر سودوموناس ها قابل تفکیک است.این باکتری ژلاتین را ذوب میکند ، اکسیداز مثبت است. در صورتی که این باکتری بر روی محیط مولر هینتون آگار کشت شود پیگمان آبی یا سبز و یا سایر پیگمان های دیگر مشاهده میگردد.این باکتری سومین علت شایع عفونت های بیمارستانی می باشد.

33. تشخیص آزمایشگاهی سودوموناس آئروژینوزا این باکتری روی محیط های آگار خوندار و مک کانکی یا EMB رشد کرده بر روی محیط مک کانکی کلنی های درشت لاکتوز منفی به وجود می آورد. سپس کلنی حاصله را بر روی محیط KIAیاTSI منتقل کنید. این باکتری بر روی این دو محیط فرم قلیا /قلیا ALK/ALK) )ایجاد کرده و روی سطح شیب‌دار آن کلنی‌هایی با جلای فلزی مشاهده می شود.  تست سیترات در این باکتری مثبت و تست های اندول ، متیل رد و VP در این باکتری منفی است و ژلاتین را ذوب می کند و قادر به تخمیر قندها نمی باشد.

34. تست اکسیداسیون فرمانتاسیونOxidation – Fermentation جهت بررسی و شناسایی باکتری هایی که قادر به شکستن کربوهیدراتها از طریق اکسیداسیون یا فرمانتاسیون (تخمیر)می باشد مورد استفاده قرار می گیرد.محیط اکسیداسیون ، فرمانتاسیون محیط مناسبی برای بررسی چگونگی مصرف قندها می باشد.سودوموناس آئروژینوزا در محیط OF گلوکز را به روش اکسیداتیو مورد مصرف قرار می دهد ، گلوکونات را اکسید نموده و کتو گلوکونات تولید می کند.

35. روش انجام تست لوله محیط کشت OFحاوی قند گلوکز ، الکترولیت ، مقدار کمی پپتون و معرف PH می باشد. باکتریها را در دو لوله کشت داده و در سطح یکی از لوله ها پارافین اضافه کنید تا شرایط بی هوازی مهیا گردد. سپس به مدت ۲۴ ساعت لوله ها را در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری نمایید. نتیجه آزمایش به صورت های زیر قابل بررسی است

36. بررسی نتایج ارگانیسم های اکسیداتیو این ارگانیسم ها توانایی تخمیر قندها را ندارند بلکه آن را به روش اکسیداسیون مصرف می کنند بنابراین فقط در شرایط هوازی ( لوله بدون پارافین) قند مصرف میشود. مصرف قند همراه با تولید اسید است که موجب تغییر رنگ معرف میشود. بنابراین فقط در شرایط هوازی تغییر رنگ معرف مشاهده میشود ( سبز به زرد) ارگانیسم های تخمیری این ارگانیسم ها توانایی مصرف قندها را به هر دو روش تخمیر و اکسیداسیون دارند. مصرف قند همراه با تولید اسید است که موجب تغییر رنگ معرف می شود. بنابراین در شرایط هوازی و بی هوازی تغییر رنگ معرف مشاهده میگردد که در هر دو لوله محیط کشت تغییر رنگ از سبز به زرد دیده میشود. ارگانیسم های غیر اکسیداتیو این ارگانیسم ها توانایی مصرف قندها را در هیچکدام از مسیر های تخمیری و یا اکسیداسیون ندارند بنابراین هیچ تغییر رنگی را در لوله های کشت ایجاد نمیکنند.

38. نکات مهم:- وجود پپتون، یونهای منیزیم و سولفات در محیط‌های کشت، استفاده از محیط‌های حاوی ژلاتین و شیر و همچنین قرار دادن محیط کشت در دمایcº 30-25، سبب افزایش تولید پیگمان می‌گردند. - برای جدا کردن این باکتری‌ها از مواد آلوده، از ترکیبات چهار ظرفیتی آمونیم و ساولن و یا از محیط حاوی 3صدم درصد ستریماید (Citrimide) استفاده می‌نمایند.