1 / 33

Биоиндикатори- предавање 2 5 . Микроорганизми као биоиндикатори

Биоиндикатори- предавање 2 5 . Микроорганизми као биоиндикатори 5 .1. Улога микроорганизама у природи - микро o рганизми: једно - или вишећелијски организми, видљиви само кроз микроскоп, величине 0,2 до 200 μ m ( < 0,2 mm) - категорија укључује гљиве, бактерије, протозое и алге

coye
Download Presentation

Биоиндикатори- предавање 2 5 . Микроорганизми као биоиндикатори

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Биоиндикатори- предавање 2 5. Микроорганизми као биоиндикатори 5.1. Улога микроорганизама у природи - микроoрганизми: једно- или вишећелијски организми, видљиви само кроз микроскоп, величине 0,2 до 200 μm (< 0,2 mm) - категорија укључује гљиве, бактерије, протозое и алге - најраширенија категорија живих бића на Земљи - у земљишту, води, ваздуху, преко 1000 метара дубоко у литосфери, аеробним и анаеробним срединама, арктичком леду и на високим температурама - адаптирали се на живот у готово свим условима - добијају Е из светлости или оксидацијом хемијских супстанци - донори електрона могу бити органске или неорганске супстанце - извор угљеника могу бити СО2 или комплексна органска једињења - микроскопске алге и фитопланктони- главни произвођачи биомасе у воденим системима 1

  2. Биоиндикатори- предавање 2 - у морима и океанима бактерије углавном разлажу супстанце које награде фитопланктони, као и њихове ћелијске остатке - бактеријска секундарна продукција чини само 20% примарне продукције фитопланктона - иако хетеротрофне бактерије могу да имају висок степен раста, измене у укупном броју врста бактерија су релативно мале - захваљујући протозоама, број брзомножећих маринских бактерија (величине 0,2-2 μm) у једном истраживању је остајао < 1х106/ml - у водама, главни организми који конзумирају бактерије су хетеротрофни флагелати (величине 2-20 μm) 2

  3. Биоиндикатори- предавање 2 - њих конзумирају веће протозое, попут цилијата - они су исте величине као фитоплантони (20-200 μm) - преко бактерија и протозоа се енергија коју су кроз стварање органске супстанце створили фитопланктони враћа у ланац исхране - више биљке су главни произвођач биомасе у терестријалним екосистемима - преко остатака биљака, али и коренског система, настала енергија и угљеникова једињења долазе у земљиште - гљиве и бактерије су главни разграђивачи мртве органске супстанце 3

  4. Биоиндикатори- предавање 2 - ту се, пре свега, мисли на остатке биљака, супстанце лучене из корења, мртве микроoрганизме, остатке животиња у земљишту - ове врсте микроорганизама су извор хране за протозое и нематоде, играју главну улогу у ланцу исхране и кружном току хранљивих супстанци - минерализацију, тј. разградњу биополимера у СО2, Н2О, минерални N и P и друге минералне елементе, изводе углавном микроорганизми - минералне хранљиве супстанце које настају разлагањем су у земљишту доступне биљкама и микробима - настаје нова биомаса, а хранљиве супстанце круже - пољопривредно земљиште (0-25 cm) дубине садржи око 3000 kg биомасе по хектару - микроби су доминантни у хемијским и физичкохемијским процесима у таквом земљишту - одговорни за преко 80% укупне активности и процеса 4

  5. Биоиндикатори- предавање 2 - у обрадивом земљишту микроорганизми годишње разложе око 5000 kg угљеника по хектару - такође произведу око 100 kg минералног азота - заправо задовоље 50% потребе за азотом пољопривредних култура - микроби и такође утичу на формирање и очување структуре земљишта 5

  6. Биоиндикатори- предавање 2 5.2. Зашто користимо микроорганизме као индикаторе? - микроорганизми су корисни индикатори у биомониторингу - присутни су у великим количинама у свим сферама животне средине - учествују у ланцима исхране и кружном току елемената (N, P, C, S) - незамењиви су живот виших организама - мала величина и висок однос површине и запремине узрокује велики афинитет за ниске концентрације супстрата - дакле, врло су осетљиви и реагују веома брзо на стрес и загађење - микробиолошка активност зависи од збира свих физичких, хемијских и биолошких фактора који утичу на процесе разградње и трансформације хранљивих супстанци - микробиолошки индикатори стога могу да послуже као средства за рано откривање проблема са којима се животна средина суочава - микроорганизми укупно представљају велику количину биомасе - такође су и веома разноврсни 6

  7. Биоиндикатори- предавање 2 - често су генетске разлике између неких биљака и животиња мање него разлике између појединих микроорганизама - пошто су широко распрострањени и мале величине, не постоји проблем са узорковањем довољно великог броја микроорганизама - практично је могуће доћи до било ког броја микроорганизама у узорку или било које величине узорка - анализа опасности по животну средину услед загађења хемијским супстанцама се обично заснива на анализи самих ксенобиотика - укупне концентрације служе да се утврди загађење и опасност - међутим, при истој концентрацији, биодоступност једињења може да се разликује од случаја до случаја - у земљишту и седиментима, у случају тешких метала, на пример, биодоступност је обрнуто пропорционална рН, садржају глине и органске супстанце - иако се, дакле, знају неки фактори који утичу, процена биодоступности на основу искључиво хемијских анализа још увек крајње несигурна 7

  8. Биоиндикатори- предавање 2 - често се раде различите екстраполације - екотоксиколошке лабораторије обично раде испитивања утицаја чистих супстанци на појединачне врсте - то, међутим, не имитира ситуацију присутну у животној средини - када се тако добијени резултати примене на реалне ситуације, обично се у мањој или већој мери греши - не узимају се у обзир интеракције између различитих живих бића и заједница, као ни ланци исхране који постоје - такође, тестови токсичности обично обухватају леталне или сублеталне исходе базиране на релативно кратком утицају ксенобиотика - њихов утицај често знатно дужи, дани, месеци, године, деценије... - резултати, дакле, слабо релевантни у односу на реалан живот - у лабораторијама акутна, у стварном животу и хронична токсичност - често су ефекти, у случају дугорочног загађења, слабији 8

  9. Биоиндикатори- предавање 2 - ксенобиотик се делимично или потпуно дезактивира везивањем за органску или неорганску фракцију земљишта - такође, и микроорганизми се прилагоде, развију одређени степен толеранције - у реалном систему је ретко један загађивач присутан сам - обично постоји више ксенобиотика - лабораторијски модели за мерење адитивне токсичности, истовремене токсичности више супстанци, слабо развијени - коначно, формално загађење често није једини стрес који екосистем осећа - ту су и еутрофикација, ацидификација, исушивање, хладноћа... - још један разлог за непоузданост лабораторијских испитивања - еколошки ефекти стреса укључују и смањење биодиверзитета и сметње у процесима као што су разлагање и кружни ток супстанци - тешко in situ мерити разлагање и минерализацију 9

  10. Биоиндикатори- предавање 2 - потребно дуго време инкубације, често године, пре него што, на пример, нагомилавање органске супстанце постане очигледно - потребни су, дакле, осетљиви биолошки индикатори - ипак, уз предности, постоје и проблеми - за разлику од биљака и животиња, код микроба још до краја нису разјашњене све разлике између појединих врста - много различитих врста, 104-105 по граму земљишта - немогуће укључити све микроорганизме у процени утицаја ксенобиотика - углавном се укључују доминанте популације 10

  11. Биоиндикатори- предавање 2 5.3. Микробиолошке методе које се користе у биомониторингу - три најчешће информације које се добијају: количина биомасе, активност и диверсификација микробиолошке заједнице - за све три информације користимо различите технике - анализе могу бити рађене са микробима из свих средина - већина касније споменутих метода (микроскопија, уградња 3Н-тимидина, DGGE) потичу из истраживања водених система - примењују се у испитивањима земљишта од 1990-тих - микроорганизми се дуго користе као индикатори квалитета вода - укупан број колиформних бактерија и број фекалних колиформних бактерија се користе за утврђивање загађења пијаћих или вода за купање патогеним бактеријама из пробавног тракта - степен еутрофикације вода се деценијама одређује мерењем броја и заступљености неких врста алги и цијанобактерија 11

  12. Биоиндикатори- предавање 2 - мерила се и њихова активност у фотосинтези (производња О2) и у дисању (БПК) - коришћење микроорганизама у земљишту као индикатора почело касније - од 80-тих година прошлог века отпочела брига због утицаја пољопривреде на квалитет земљишта - преко микробиолошких индикатора могуће дати брзу оцену стања - бактерије се, генерално, користе чешће него гљиве и протозое - гљиве и протозое су важне у екосистемима, али се тешко “мере” - још увек се развијају технике за одређивање ДНК гљива - нису рутинизиране ни технике за одређивање биодиверзитета гљива 12

  13. Биоиндикатори- предавање 2 5.4. Одређивање количине биомасе микроорганизама - класичан начин за одређивање количине живих микроорганизама је да се посеју на хранљиву културу у стакленом суду - Петри 1887. први описао - бактерије формирају колоније, број зависи и од коришћене културе - око 1% бактерија из животне средине може да се одреди на овај начин - коришћењем микроскопа, као и аутоматизованом анализом снимака, могуће је добити информације о укупном броју, биомаси и морфолошким карактеристикама микробиолошке заједнице - често се обележавају флуоресцентним бојама - други могући метод за одређивање укупне биомасе у земљишту је заснован на повећању екстрактабилног С и N након засићења узорка земљишта парама хлорофома - хлороформ разара ћелијске мембране, тако да садржај ћелија прелази у раствор 13

  14. Биоиндикатори- предавање 2 - на основу разлике у односу на контролни, необрађени, узорак, се добија количина биомасе, тј. органског С и N - како се око 50% биомасе екстрахује на овај начин из земљишта, неопходно је користити корекционе факторе - елегантнија и савременија метода је да се уместо хлороформа користе микроталаси. 14

  15. Биоиндикатори- предавање 2 5.5. Одређивање активности микроорганизама - микробиолошка активност може бити релативно лако одређена мерењем дисања земљишта под стандардизованим условима у лабораторији - у већини земљишта где је доступност лако разградивих супстанци ограничена, ово захтева 2-6 недеља инкубационог периода - још једна коришћена техника је дисање индуковано супстратом - Substrate Induced Respiration (SIR) 15

  16. Биоиндикатори- предавање 2 - мери се повећано дисање (ослобађање СО2) након додавања лако деградабилног супстрата (глукозе), у првим сатима након додавања - дисање ће бити мера одговора, самим тим и мера укупне биомасе - брзина раста бактерија може бити мерена брзином уграђивања 3Н-тимидина у ДНК и 14С-леуцина у протеине - ово се ради током релативно кратке инкубације (1 сат) - праћење оба параметра у једном експерименту омогућује истовремено праћење синтезе и ДНК и протеина 16

  17. Биоиндикатори- предавање 2 - садржај ДНК код бактерија је константнији од садржаја протеина - због тога је инкорпорација тимидина боље мерило за брзину раста - ћелије синтетишу више протеина него ДНК - због тога је инкорпорација леуцина за ред величине већа од инкорпорације тимидина, лакше се мери и поузданија је при малим брзинама раста 17

  18. Биоиндикатори- предавање 2 - само бактерије инкорпорирају тимидин, али све бактерије не инкорпорирају 3Н-тимидин - све бактерије инкорпорирају леуцин, али леуцин могу да инкорпорирају и други организми - како су обе методе појединачно непоуздане, користе се симултано 18

  19. Биоиндикатори- предавање 2 - потенцијална брзина минерализације азота и угљеника може да се одреди симултано, инкубацијом у току шест недеља, при 20 °С, и при влази од 50% у односу на максимално могућну - брзина минерализације се рачуна на основу повећања количине минералног азота након шесте у односу на повећање након прве недеље од почетка експеримента - важно: резултат у првој недељи се не узима у обзир - брзина минерализације угљеника се рачуна на основу количине издвојеног СО2 између прве и шесте недеље - у неким маринским земљиштима, која садрже велике количине СаСО3, мерење издвојеног СО2 није поуздано - рачуна се потрошња О2, рачунајући да један мол О2 потрошеног одговара једном молу развијеног СО2 - наравно, О2 потрошен за нитрификацију се одузима 19

  20. Биоиндикатори- предавање 2 5.6. Хемијске технике за одређивање микробиолошког диверзитета - метод отиска липидног маркера (signature lipid biomarker, SLB) је најшире коришћен стриктно хемијски метод за проучавање заједница микроорганизама - липиди у микроорганизмима се налазе у ћелијским зидовима, али и у залихама које микроорганизми стварају у време интензивне исхране - SLB може да, у својој најсавршенијој форми, пружи врло различите податке о заједницама микроорганизама - липиди могу да буду екстраховани, фракционисани и анализирани GC-јем - како анализа свих фракција липида захтева време, обично се само неке фракције анализирају - једна од таквих фракција, фосфолипиди, се не налазе у залихама које микроорганизми стварају, ни у мртвим ћелијама - налазе се искључиво у ћелијских зидовима живих ћелија 20

  21. Биоиндикатори- предавање 2 - већина студија користила масне киселине фосфолипида како би сеиспитивала микробиолошка структура - иако појединачне киселине нису често карактеристичне за организам или групу организама, могу бити коришћене као биохемијски маркери - доминирају у појединим таксономским групама и константних су концентрација 21

  22. Биоиндикатори- предавање 2 - мерење концентрација фосфолипидних масних киселина екстрахованих из земљишта може да пружи податке о заједницама микроорганизама - показаће структуру, као и који су микроорганизми доминантни - неће дати квантитативну информацију о броју врста/организама - мерење укупне биомасе преко укупне количине фосфолипидних масних киселина или подгрупе одређених дало добре резултате - добра корелација са другим методама за утврђивање укупне биомасе - састав фосфолипидних масних киселина зависи и од типа земљишта, присутне вегетације, климе и начина управљања земљиштем - укупно узевши, ипак добра и осетљива метода - често указује на стрес док друге га методе још не показују - добра метода за мониторинг због једноставности, брзине и могућности за стандардизацију и аутоматизацију - потребно још радити на развоју интерпретације резултата 22

  23. Биоиндикатори- предавање 2 5.7. Генетске технике за одређивање микробиолошког диверзитета - различите методе су развијене како би се одредила генетска различитост - ДНК је екстрахован из узорака земљишта, седимената и вода - Добијени ДНК је мултипликован PCR-ом и раздвајан коришењем DGGE (denaturating gradient gel electrophoesis) - ДНК фрагменти једнаке дужине се ставе на гел на коме постоји градијент денатуризационог агенса - током електрофорезе ДНК фрагменти се крећу кроз растући градијент денатуризационог агенса - у зависности од састава ДНК, фрагменти стварају траку на месту одређене концентрације денатуризационог агенса - број ДНК трака зависи од броја генотипова специфичних бактерија - интензитет траке зависи од количине ДНК, тј. количине врсте - друге технике се такође користе 23

  24. Биоиндикатори- предавање 2 24

  25. Биоиндикатори- предавање 2 - temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) - температурни градијент у полиакриламидном гелу денатурише - након тога исти приступ као пре, анализирају се траке и њихов интензитет, уз фотографисање и анализу фотографија - аmplified ribosomal DNA restriction analуsis (АRDRA) - након PCR-а се користи дигестија рестрикционим ензимом, па електрофореза на агарозном гелу - АRDRA показује квалитативне разлике између заједница, али није у стању да пружи податке о броју јединки 25

  26. Биоиндикатори- предавање 2 26

  27. Биоиндикатори- предавање 2 5.8. Физиолошке технике за одређивање микробиолошког диверзитета - физиолошки приступ анализи микробиолошке популације је заснован на способности заједница да метаболишу различита С-једињења - различита органска једињења, од 31 до чак 95, истовремено појединачно служила као извор угљеника - мерила се брзина прераде једињења - промене у брзини или природи прераде угљеникових једињења означавају промене у метаболизму, а ове могу бити последица стреса - резултат зависи од густине колонија, тј. од броја бактерија које прерађују једињења - препоручљиво да се, када се раде поређења, користи исти број колонија као у студијама са чијим се резултатима врше поређења 27

  28. Биоиндикатори- предавање 2 5.9. Референтне вредности - особине микроорганизама не зависе само од антропогеног стреса, већ и од карактеристика земљишта - зависе од рН, садржаја органске супстанце, глине и алумосиликата, количине органске супстанце која може послужити као храна - због тога је неопходно имати слепу пробу, тј. узорак који је изложен свим утицајима који утичу на заједницу, осим антропогеног стреса - уколико то није могуће, покушава се да се земљишни систем опише, ради репродуцибилности и тумачења резултата, кроз неке друге величине - специфично дисање, тј. количина развијеног СО2 по јединици биомасе или однос Сбиомаса/Соргански - овакви стандарди описују земљишни систем, али не могу да реше проблем недостатка слепе пробе 28

  29. Биоиндикатори- предавање 2 5.9. Одређивање повезаности између загађења и теренских резултата - до сада описане технике дају могућеност да се одреде квалитативни аспекти екосистема - проблем је, међутим, да се сазна узрок тог квалитета - да ли је квалитет или његова промена узрокован стресом? - који је стрес, и да ли је антропогени стрес у питању? - могуће сазнати статистичком анализом, ако постоји довољна количина података - једна од могућих последица је да се заједница која је изложена прилагоди тако што ће повећати своју толерантност - то је могуће на више начина, физиолошком или генетском адаптацијом, губитком најосетљивијег дела заједнице, реколонизацијом локације толерантним јединкама - pollution induced community tollerance (PICT) 29

  30. Биоиндикатори- предавање 2 - корисно за испитивање ефекта загађивача на терену - праћењем промена толерантности се долази до података о реалном утицају који је изазвао повећање толеранције - PICT боље дефинише каузалност него друге класичне анализе 30

  31. Биоиндикатори- предавање 2 5.10. Неки аспекти практичне примене - који је ефекат загађивача? - који је укупан ефекат загађивача, начина коришћења земљишта и других узрока стреса на заједницу микроорганизама? - коришћење различитих техника доказало да тешки метали утичу на заједнице микроорганизама - повећање концентрације утиче на дисање у шумским земљиштима, али нема једнозначних резултата за пољопривредна земљишта - генерално, дисање није довољно добар биоиндикатор, јер нема мерљивих промена при концентрацијама испод ЕУ лимита - уграђивање 3Н-тимидина дефинитиво осетљивије према загађивању него промена биомасе или брзина дисања код земљишта и вода - што се тиче гљива, различити истраживачи дају конфузне закључке - неки тврде да су мање, други да су више осетљиви од бактерија 31

  32. Биоиндикатори- предавање 2 - када је CuSO4додаван земљишту при рН 5,0, већ при 10 mgCu/kg примећен је пад брзине уграђивања 3Н-тимидина - бактеријска биомаса и брзина дисања су се смањивали при знатно већим концентрацијама (100-1000 mgCu/kg) - брзина раста у овом случају бољи индикатор од биомасе или дисања - експеримент са три различите локације и песковитим земљиштима - једно загађено Cu (максимум 160 mgCu/kg), друго са Ni и Cr (2.800 и 430 mg/kg), треће са Zn (10.000 mg/kg) - на земљишту загађеном Cu, брзине како уградње 3Н-тимидина, као и 14С-леуцина су значајно пале у односу на земљиште са природном концентрацијом већ од 25 mg/kg - уградња 3Н-тимидина опада при концентрацијама које су ниже од тренутне максимално дозвољeне концентрације у ЕУ (140 mg/kg) - већина других параметара, биомаса бактерија и гљива, протозоа и нематода, брзина дисања и N-минерализација такође опадају са растом концентрације Cu 32

  33. Биоиндикатори- предавање 2 - разлике међутим нису статистички значајне, поново је пад брзине раста бактерија најосетљивији биоиндикатор - код земљишта загађеног Ni и Cr, брзина раста бактерија, али и бактеријска биомаса опадају са повећањем концентрације метала - као и у случају бакра, брзине уградње 3Н-тимидина, као и 14С-леуцина су значајно пале, при чему је брзина уградње 3Н-тимидина више опала - генерално, повећане концентрације метала инхибирају синтезу ДНК више него синтезу протеина - код земљишта контаминираног Zn, сви параметри, поготово везани за број и масу микроорганизама, али и брзина минерализације C су били знатно нижи него код земљишта које је ремедирано 33

More Related