大肠杆菌及其染色体

1. 大肠杆菌及其染色体 刘 超 10808073 2009-05-20

2. 综述与要点 • 大肠杆菌染色体是一种环状的DNA双链分子，在活细胞中，DNA体积进行1000倍压缩，只在其细胞体积中占15 ％。 • 基因组（染色体）的管理是有规律性的，这有利于染色体维护和操作。 • 新技术的发展，如基因位点的标记与分子水平的遗传位点同步跟踪，（也就是说，随时间的推移，这种分子机制能在活细胞内检测出）。 • 这些研究通过基因定位，对染色体的复制进行可视化，揭示出一个高通量的动态的基因复制和大分子行为。

3. 免疫组织化学方法 荧光分子机制 荧光原位杂交（ FISH ） 荧光阻遏子-启动子系统(FROS ） ParB–parS 系统 用于 染色体相关的 显微镜成像方法

4. 免疫化学 这些方法需要固定的细胞因而样品破坏。 此外，抗体相互作用可导致降低效率。 利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量。

5. 荧光蛋白 在活细胞中，利用含有绿色荧光蛋白（ GFP ）融合蛋白，彻底让我们直观地观察和理解细胞组织的功能。 利用不同的荧光蛋白质，就可以在同一时间追踪多种成分的活体细胞。

6. 荧光原位杂交（ FISH ） 荧光原位杂交（fluorescent in situhybridization，FISH） 是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA。 DNA探针，通常为2-10 kb 的长度，探针带有标记作用的荧光基团。 同时检测多个位点，不要求建造特殊菌株。 固定过程和通透性可以干扰染色体原来的序列。 人类染色体的原位杂交

7. 阻遏子-启动子的荧光系统 ( FROS) FROS是第一个在活细胞中直观具体地观察染色体行为的方法。利用了不同的荧光蛋白基因变异型（GFP、YFP、RFP）具有不同的发射光谱，把他们融合到LacI和TetR等不同的抑制子中，在细胞中，这些融合蛋白表达，并与lacO和tetO等特异性位点结合从而插入并结合到染色体中。 可以用荧光显微镜观察，使得染色体可视化。 但是，这种方法要求利用转座子在染色体中建造一系列随机结合位点（ lacO和tetO ） 需要防止这种抑制作用过度。 FROS允许快速摄像和微速摄影，同时可以跟踪两个或三种颜色（激光共聚焦）。

8. 利用阻遏子-启动子的荧光系统 ( FROS)来观察大肠杆菌的染色体复制的情况。 (Wang, X. et al.,2006,Genes Dev )

9. ParB–parS 系统 ParB–parS 系统也是利用荧光融合蛋白（ParB）和特异性识别位点（parS）特异性结合的方法，在细胞中，使染色体轨迹可视化。 ParB EGFP YFP RFP

10. 环状DNA的拓扑学知识 • 共价闭合的DNA，不足以形成稳定的负超螺旋结构，但是在不同条件下，它可以存在于两个可以互换的形式——绞状螺旋线的环形结构和超螺旋的环形结构。 • 在体外，在生理缓冲液中，绞状螺旋线的螺旋结构通过右手旋线的环形结构构象。 • 环状的DNA能通过某些蛋白，形成稳定的左手螺旋环超环面负超螺旋结构的，这种结构具有更高水平的折叠和压实。

11. = 具体结构稍后再讲 大肠杆菌的染色体复制概述 L:把环状DNA“人为平铺打开”后从Ori的左边进行复制的复制轨迹； R:把环状DNA“人为平铺打开”后从Ori的右边进行复制的复制轨迹； ter：L和R复制叉最后“碰面”的在一定区域，复制终止区域。 L/R的颜色的强弱表示时间梯度 ——颜色越强，越靠后，越下游。 大肠杆菌的复制“对称”，ori，ter位于菌体“中间”，其他的菌种是不是也是这样的？？

12. 柄杆菌属 枯草芽孢杆菌 具有 ori-proximal pole ter-proximal pole而大肠杆菌的ori和ter在菌体“中间”位置 复制过程和大肠杆菌基本相同。但是，染色体复制后，被整编和拉长，两个染色体的Ori被一些列的蛋白固定在细胞两极， 如：DivIVA, RacA, soj 和 Spo0J。 SpoIII 把一个细胞极的挤进到前芽孢中。 为不对称分裂。 弧菌属 有两个独立环形染色体，独立控制两个Ori 其他菌种的复制简介

13. E.coli 复制体 • 大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与。 • 整个DNA复制机制被称之为DNA replicase system或replisome（复制体）。

14. E.Coli 复制相关的酶 • Helicase（解旋酶），任何DNA在被复制前都必须解开双链，这个过程是由helicase来完成的，它可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。 • Topoisomerase（拓扑异构酶），主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。 • DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。 • Primases（引物酶），为DNA复制提供RNA引物。 • DNA polymerases，合成新生DNA链，切除RNA引物。 • DNA Ligases，使新生DNA链上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯键。

15. 1.DNA复制的起始 • 大约20个左右的DnaA蛋白首先与OriC中的4个9碱基重复区相结合； • 识别并使3个13碱基串联重复区DNA形成开环结构； • DnaB蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个DnaB蛋白形成一组并与一条DNA母链结合，可在不同方向同时起始DNA的复制。当细胞中存在足够的SSB和DNA解旋酶时，DnaB的解链效率非常高。 • 大肠杆菌中的复制起始位点是oriC,全长245 bp。 • 该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。

16. 2.DNA子链的延伸 • 主要包括两个不同但相互有联系的事件，即前导链和滞后链的合成。由DNA helicase解开双螺旋，由拓朴异构酶消除DNA链上的扭曲力，SSB结合使DNA单链稳定。 • 前导链的合成：由DnaG（primase，引物酶）在复制起始位点附近合成一个RNA引物，然后由polII把dNTP加到该引物上。 • 滞后链的合成：产生Okazaki fragments(冈崎片段)，消除RNA引物并由DNA pol I补上这一小段DNA序列，由DNA Ligase把两个片段相连。

17. L/R 双向复制叉

18. 3. DNA链的终止 当子链延伸达到terminus region（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（ter utilization substance）来完成的。

19. 我们现在看看整个E .coli在细胞内的复制全过程。 从oriC开始双向复制 随着复制的进行，两个子oriC分开 随着复制的继续进行，形成一种特殊的“图像” 复制接近尾声，两个复制叉“碰面”，复制终止 复制完成后，得到两个完全相同的大肠杆菌

20. 我们用本文参考文献的荧光图片来对照 (Wang, X. et al.,2006,Genes Dev )

21. 总结与展望 • E.coli 是典型的真细菌代表，原核生物中，迄今为止利用面最广，利用价值最大，如工程菌。 • 通过E.coli染色体的研究对其他细菌的复制研究具有参考和启示的作用。 • 在遗传和生物学进化上有价值。

22. THANK YOU