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藕合型生物毒素 BtA 的合成及杀虫机理研究

藕合型生物毒素 BtA 的合成及杀虫机理研究. 报告人：潘志针 福建省农业科学院农业生物资源研究所 二 O 一二年五月二十三日. 研究意义. 基因突变. 新型 Bt 毒素筛选. 蛋白质工程. 研究内容. B t A 生物藕合体系的构建 - B t 毒素蛋白的纯化 - 阿维菌素的结构修饰 - 藕合试剂的选择与藕合条件的优化. B t A 杀虫作用机理的研究 - Octet RED System 技术的介绍 - BtA 与 BBMV 相互作用的研究 - B t 和 BtA 杀虫毒力的比较. BtA 藕合体系.

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藕合型生物毒素 BtA 的合成及杀虫机理研究

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  1. 藕合型生物毒素BtA的合成及杀虫机理研究 报告人：潘志针 福建省农业科学院农业生物资源研究所 二O一二年五月二十三日

  2. 研究意义 基因突变 新型Bt毒素筛选 蛋白质工程

  3. 研究内容 • BtA生物藕合体系的构建 • - Bt毒素蛋白的纯化 • - 阿维菌素的结构修饰 • - 藕合试剂的选择与藕合条件的优化 • BtA杀虫作用机理的研究 • - Octet RED System技术的介绍 • - BtA与BBMV相互作用的研究 • - Bt和BtA杀虫毒力的比较

  4. BtA藕合体系 BtA藕合体系的构建 Bt毒素蛋白的纯化 阿维菌素结构修饰 新型藕联剂 NHS+EDC BtA藕合效率的检测

  5. Bt毒素蛋白的纯化 • Bt晶体的提取 发酵培养：挑取活化的HD-1接种于LB液体培养基中，30 ℃ 200r/min摇瓶发酵培养3天。 碱裂解：待芽孢产生时，将发酵液于4℃、10,000 g离心10 min，取沉淀。沉淀重悬于50 mmol/L Na2CO3（pH 10，含50 mmol/L的EDTA，3%巯基乙醇）缓冲液中，4 ℃静置2 h 等电点沉淀法提取Bt晶体：取菌悬液于 10,000 g 离心30 min，取上清用4 mol/L NaAc–Hac（pH值4.0）调节pH值至5. 0左右。4℃静置过夜， 10000r/min 离心30 min，灭菌去离子水洗涤3次，沉淀冷冻干燥后-20℃保存。 • Bt菌株：HD-1 • 方法：等电点沉淀法 苏云金芽孢杆菌晶体

  6. Bt毒素蛋白的纯化 1-Bt原毒素 2-BtA毒素 3-胰蛋白酶降解的Bt毒素 4-胰蛋白酶降解的BtA毒素 冷冻干燥后的Bt晶体

  7. 阿维菌素羧基化改造 4’’ C-7 双糖结构 “勺柄” 大环内酯结构 5

  8. 阿维菌素的改造路线 C5-OH的保护 氮气保护下的反应装置图 4’’-O-琥珀酰-AVM的合成 对甲磺酸苯磺酸 乙酸乙酯和水萃取 C5-OH的脱保护处理 硅胶柱层析 TLC

  9. 质谱和核磁鉴定

  10. 三功能 交联剂 零长度交联剂 异型双功能 交联剂 同型双功能 交联剂 生物藕合试剂 两端带有不同的功能基 胺反应性的交联剂 两端带有相同的 功能基 胺和巯基反应性的交联剂

  11. 生物藕合试剂的选择 EDC/NHS藕合 《生物藕合技术的原理与应用》P94

  12. BtA藕合效率的检测 • 荧光滴定法测定BtA藕合效率 蛋白质由于含有酪氨酸色氨酸等基团，会使蛋白质发出荧光。随着阿维菌素与Bt晶体的藕合会使Bt晶体的构象或引起内源荧光发射的氨基酸残基的微环境发生变化，从而导致其荧光光谱的最大发射峰等的变化由此我们可以建立Bt晶体与阿维菌素结合的荧光滴定模型。

  13. 荧光滴定模型 Kd’为小分子与蛋白质结合的本征结合常数，P表示游离的Bt蛋白的浓度，R表示游离的4"-O-琥珀酰阿维菌素的浓度，PR表示藕合的BtA的浓度。n表示BtA中结合的4"-O-琥珀酰阿维菌素的分子数。设a为Bt蛋白上与4"-O-琥珀酰阿维菌素结合的位点的百分数，Po表示总的Bt蛋白的浓度，Ro表示总的4"-O-琥珀酰阿维菌素的浓度，那么R=Ro-PR=Ro-nPo（1-a），则得到：

  14. 荧光滴定模型 此外，由滴定曲线我们又可以得到： F表示在适当的Ro时的荧光强度。Fmax表示滴定饱和时的荧光强度。Fo则表示滴定前的荧光强度，进而测定本征结合常数和藕合位点数。

  15. 荧光滴定体系 配制 5 μM的Bt蛋白母液，3 mM和7.5 mM的阿维菌素及4"-O-琥珀酰阿维菌素的母液。 固定荧光分光光度计的光路，加入1ml的Bt蛋白母液，按Bt蛋白摩尔浓度倍数0.6、1.2、1.8、2.4、3、4.5、 6、7.5、9、10.5的倍数，逐次加入阿维菌素及4"-O-琥珀酰阿维菌素，每次1μl 。 25℃，激发波长为280 nm，激发狭缝和发射狭缝宽均为5 nm，扫描范围285~430 nm，扫描速度600 nm/min，每个1 nm收集一次数据，荧光发射光谱均扫描3次取平均值。

  16. 荧光滴定结果 阿维菌素滴定Bt蛋白 M DMF（溶剂对照） 阿维菌素 改造并活化后的阿维菌素 4“-O-琥珀酰AVM滴定Bt蛋白

  17. 荧光定量滴定法测定BtA藕合效率 n=5 Kd=6.44 μmol/L 1-Bt原毒素 2-BtA毒素 3-胰蛋白酶降解的Bt毒素 4-胰蛋白酶降解的BtA毒素

  18. 荧光滴定法测定BSA-A藕合效率 4-O-琥珀酰AVM滴定BSA蛋白的荧光图谱 NHS/EDC活化后4-O-琥珀酰AVM滴定BSA蛋白 1-BSA 2-BSA 3-BSA-A 4-BSA-A n=5.3 Kd=25.7 μmol/L

  19. 研究内容 一、BtA生物藕合体系的构建 二、BtA杀虫的机理的研究 Gill et al.（2002）研究发现Bt毒素蛋白的杀虫毒力主要与靶标害虫BBMV上受体的相互作用有关。因此BtA杀虫机理的研究将围绕着BtA与BBMV上受体的相互作用情况展开。

  20. Bt毒素杀虫机制 Bravo A et al. 2000

  21. Octet RED System 组成

  22. Octet仪器中内部主要结构

  23. 当一束可见光从光谱仪射出后，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱。当一束可见光从光谱仪射出后，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱。 任何由于分子结合而形成的膜层厚度变化，能够通过干涉光谱的位移值而体现。 Octet RED System原理： 生物膜干涉技术

  24. 100% Relative Intensity 0 Wavelength (nm) 干涉光谱位移-时间曲线图可以提供动力学参数 Distance between the two reflecting surfaces = ℓ nm shift Intensity λ=ƒ(λ, ℓ) Function of density and optical thickness Time

  25. NH2 H2N Biotin H2N NH2 NH2 靶标蛋白的固化 生物素-链霉亲和素（SA 传感器）: Streptavidin biosensor NH2 Minimal biotinylation (in solution) Biotin–linker-NHS Immobilization Streptavidin biosensor Biotin 生物素的标记以及标记的蛋白的固化不受环境影响，蛋白由于标记而失活的概 率很低。 在中性的pH与温和的环境中反应，生物素与蛋白的摩尔比最好比较低（理想的是1:1） 生物素标记后需要用脱盐柱除去剩余的生物素试剂，生物素链霉亲和素非常稳定，可重复 性好，而且易于保存。

  26. Amine Reactive biosensor Amine Reactive biosensor Amine Reactive biosensor Immobilization Activation EDC/NHS NHS NHS NHS COOH COOH COOH NH2 COOH H2N NH2 NH2 传感器的固化 直接偶联（最普遍的是胺基偶联，AR传感器） 蛋白质的固化在酸性的pH 中进行(commonly pH 5); 一般需要对pH进行优化。 容易导致蛋白失活 很多偶联试剂需要新鲜配制，而且需要加入封闭步骤（乙醇胺） 与本项目生物藕合的原理一致

  27. Octet平台动力学检测自动化流程 Baseline Baseline Loading Octet Biosensors Binding (nm) Buffer Ligand-Biotin Protein of Interest Association Dissociation Time • 一次检测8个通道 • 所有数据是实时的 • 反应的时间，位置，转速，温度，步骤可以自行设定 • Baseline, Association和Dissociation三步对于计算动力学参数KD值是必须得。

  28. 动力学参数的计算 ka Ab + Ag Complex kd kd ka KD = 1:1 binding模型: ka = 结合常数，Kon kd= 解离常数，Koff Non-linear curve fit of data  Y=Y0+Req(1-e-kobs*t) Y=Y0+Ae-kd*t Kobs=Ka*[S]+Kd

  29. 动力学参数的特性 表观结合常数，kobs Kobs与浓度呈线性关系，斜率为Ka,截距为Kd.(kobs = ka[S] + kd). 结合常数, ka 复合物（AB）的形成速率，在1M的A或B下，每秒产生的复合物数量 单位为M-1s-1, 一般从103 到107 M-1s-1 解离常数, kd 反应了复合物的稳定性, 每秒中解离的复合物的百分比 kd= 0.01 s-1= 每秒钟有1%的复合物解离 Kd越大，解离越快 单位为s-1, 一般在10-2至10-5 s-1. 亲和常数, KD kd/ka的比值. 是平衡常数的倒数。当浓度为KD时，平衡信号Req为Rmax的一半 Req= Rmax*[S]/(KD+[S])，求得KD 表示了相互作用亲和能力的大小。

  30. Bt、BtA与BBMVs的相互作用的研究 生物素标记Bt、BtA蛋白 靶标害虫中肠的提取 脱盐柱去除未标记的生物素 BBMVs蛋白的分离纯化 Octet RED System 研究Bt、BtA与靶标害虫中肠BBMVs上受体的相互作用 标记Bt、BtA固定于探针

  31. Bt毒素与BBMVs的相互作用的研究

  32. BtA毒素与BBMVs的相互作用的研究

  33. Bt、BtA与BBMV相互作用的研究 Bt与BBMV的解离常数（KD)和解离速率（kids） BtA的kids值仅 为Bt的44% BtA的KD值仅 为Bt的29% BtA与BBMV的解离常数（KD)和解离速率（kids）

  34. Bt和BtA杀虫效果的比较 • 以小菜蛾为供试虫研究Bt与BtA的杀虫毒力

  35. 技术展望 BtA藕合效率的鉴定 荧光光谱法 高效液相色谱法 SDS-PAGE法 Octet RED System BtA对靶标害虫抗药性延缓的机理 蛋白质组研究BtA对受体表达作用 RT-PCR研究BtA对受体表达影响 BtA与靶标害虫中肠受体的结合 BtA在靶标害虫中肠的定位

  36. 谢谢

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